iTRAQ/SILAC/DIGE/蛋白表達純化

iTRAQ技術服務

定量蛋白質組學技術概述：

1、基于2-DE的染料染色方法的定量策略：

考染、銀染、熒光染色。

考然和銀染的靈敏度、動態范圍、準確性差。

熒光染色的靈敏度和準確性比較好。

2、基于質譜技術的定量策略

3、非標記的定量策略:?Spectrum?Count，MRM

4、標記定量策略：iTRAQ，iCAT，?SILAC

iTRAQ標記定量技術原理

?iTRAQ試劑為可與氨基酸N端及賴氨酸側鏈連接的胺標記同重元素(isobaric)。在質譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標記的不同樣本中的同一蛋白質表現為相同的質荷比。
在串聯質譜中，信號離子表現為不同質荷比(114～117)的峰，因此，根據波峰的高度及面積，可以得到蛋白質的定量信息。?

iTRAQ標記定量技術實驗流程：

樣品→酶解→標記→混合→質譜→數據分析

iTRAQ標記定量技術樣品制備

☆需要蛋白量：每個樣品至少100ug?

☆全蛋白：直接加入裂解液勻漿或超聲，或者液氮研磨后加入裂解液。注意裂解液中不能含有Tris，硫脲等含有游離氨基的試劑。

☆亞細胞器蛋白：勻漿后差速離心或超速離心分離亞細胞器，再用裂解液裂解亞細胞器。

☆血漿等含有高峰度蛋白的樣品：需提前去除高峰度蛋白。

蛋白定量一定要盡量準確。

☆酶解前用丙酮沉淀去除樣品中的尿素等變性劑，再用試劑盒提供的buffer重溶蛋白。

☆標記前標記試劑用50-60ul異丙醇懸起，肽段的濃度應該在2-5ug/ul，肽段溶液的體積與標記試劑中異丙醇的體積之比不能高于2：3。

☆標記結束后先用MALDI-TOF檢測標記的情況，如果不好可再加一遍標記試劑

☆確認標記成功后將各樣品混合在一起，用SCX分離成10-20個組分。所用的液相體系為KH2PO4+KCl。

☆用C18再將所有組分脫鹽、抽干、重溶。

☆用MALDI檢測每個組分的肽段組成情況，組成接近的或者肽段含量少的合并到其他組分中。

iTRAQ標記定量檢測儀器

☆要求儀器精確度高，可測低質量端。

☆三級四極桿質譜，如ABI?公司的Q?Star、Q?Trap。

☆QTOF

☆LC-MALDI-TOF

iTRAQ標記定量結果分析：

分析軟件：

Wrap-LC,?Scaffold?Q

分析流程：

質譜原始數據→軟件提取每副質譜圖的保留時間、峰強度、碎片離子質量信息→生成mjf、xml等格式的文件→數據庫檢索→根據一個或多個unique?肽段的報告離子的強度變化計算出蛋白豐度的變化倍數→歸一化處理→軟件提取搜索結果中匹配肽段的保留時間、報告離子的強度等信息。

iTRAQ技術主要特點：?

1、分離能力強、分析范圍廣?

2、定性分析結果可靠，可以同時給出每一個組分的分子量和豐富的結構信息?，MS具備高靈敏度、檢測限低?，分析時間快，分離效果好?，自動化程度高?

3、TRAQ技術不僅可發現胞漿蛋白，還有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白?

4、iTRAQ技術可檢測出低豐度蛋白、強堿性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白

iTRAQ技術-樣品準備：?

蛋白運輸：24小時內可以4度運輸?

蛋白長期保存：-20度?

待檢測蛋白要求：蛋白量最低50ug，濃度最低要?為5ug/uL?10ul?

蛋白提取試劑要求：使用普通的組織、細胞裂解液即可，切忌不要使用二維電泳試劑提取。

注意事項：?

☆客戶所提供的待測蛋白量最低要求50ug，濃度最低要為5ug/uL，否則準確度低。

☆或者您直接提供組織或細胞，后續操作全部由我們來做。?

☆itraq服務您只需要提供樣本，其他試劑都無需提供。

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SILAC技術服務

SILAC 的是分別用天然同位素(輕型)或穩定同位素(重型)標記的必需氨基酸取代細胞培養基中相應氨基酸，細胞經 5-6 個倍增周期后，穩定同位素的氨基酸完全摻入到細胞新合成的蛋白質中替代了原有氨基酸。不同標記細胞的裂解蛋白按細胞數或蛋白量等比例混合，經分離、純化后進行質譜鑒定。

技術優勢

·?該技術屬于體內標記，標記效果穩定，細胞在傳代6-8代之后，蛋白標記效率可達90%以上。其標記效率不受裂解液的影響，不僅適合與進行全細胞蛋白的分析，還適合膜蛋白的鑒定與定量。

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