產品簡介

本品是一款可直接對全血樣本進行PCR擴增而無需進行DNA純化或樣本預處理的試劑盒，兼容含EDTA、肝素、檸檬酸鹽等常規抗凝劑的新鮮血液、冷藏（凍）血液及Whatman903®和FTA®商用干血漬。試劑盒中含有經過經基因工程改造的DNA Polymerase組合，具有保真性高、對PCR抑制劑耐受性強的特點，2× Blood Direct PCR Buffer中添加強力延伸因子、擴增增強因子以及優化的緩沖體系，能夠在快速延伸條件下高效擴增8 kb的基因組片段，對于2 kb以下的片段，設置3-5 sec/kb延伸時間即可完成擴增，從而大幅縮短血液樣本的鑒定及檢測時間。

本試劑盒的擴增產物的3’端為平末端，適用于一步法快速克隆及TOPO克隆試劑盒（Arcegen CAT# N132081）。試劑盒中提供的引物預混液Positive control primer mix (10 μM each)能夠從哺乳動物和大多數脊椎動物的sox21基因上游保守序列中擴增出長度237 bp的片段，可作為陽性對照使用。

產品規格 

組分信息

產品儲存

-25~-15℃保存，有效期1年。

適用范圍

不同類型的全血樣本直接PCR反應。

操作注意

1）推薦血液模板使用量為反應總體積的10%，即50 μL反應體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。

2）延伸時間10 sec/kb可擴增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴增大部分2 kb以下片段。若擴增效率較低，可適當延長時間至30 sec/kb。

3）PCR反應結束后，推薦將反應產物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細胞碎片，取上清進行下游分析。

4）本產品不可直接用于醫療診斷。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

操作說明

PCR反應體系

表1. PCR反應體系

【注】：各組分使用前應充分混勻。

a. 使用前請充分混勻各組分。

b. 推薦每條引物的使用終濃度為0.4 μM，過高會導致非特異性擴增。

c. 最佳全血模板濃度范圍為0.5%-20%，推薦使用量為10%作為初始嘗試條件，即50 μL反應體系中加入5 μL全血作為模板，注意避免吸取血液凝塊。對于貯存在Whatman®濾紙卡上的干血漬，則可取約1 mm2帶血漬的圓紙片，無需進行預處理，直接放入PCR反應液中即可進行擴增。

PCR反應條件

表2 PCR反應程序

【Note】：

1) *退火溫度為通用Tm值或低于引物Tm值1-2℃。如果擴增產物特異性較差，可以建立退火溫度梯度以尋找最佳退火條件。

2) **延伸時間10 sec/kb可擴增8 kb以下大部分目的片段，3-5 sec/kb即可擴增大部分2 kb以下片段。若擴增效率較低，可適當延長時間至20-30 sec/kb，不應超過60 sec/kb。

PCR產物分析

PCR反應結束后，推薦將反應產物于4000 rpm (1000× g) 離心1-3 min以沉淀血細胞碎片，取上清進行下游分析。該步驟可消除全血中多種殘留成分對電泳檢測的干擾，對使用高濃度血液作為模板的PCR產物尤為必要。通常，5 μL/50 μL (10%)反應產物可取30-35 μL上清，3 μL/50 μL (5%)反應產物可取40-45 μL上清。若需對PCR產物進行其它分析，例如酶切等，應將產物稀釋2-4倍以降低反應中的鹽及其它抑制劑對反應的干擾。

對照反應

試劑盒內提供引物預混液Positive Control Primer Mix (10 μM each) 用于陽性對照反應?？蓮牟溉閯游锛捌渌S多脊椎動物的基因組sox 21基因上游序列中擴增出237 bp的片段，該擴增區是一段高度保守的非編碼區。

Primer F: 5'- AGCCCTTGGGGASTTGAATTGCTG -3'   

Primer R: 5'- GCACTCCAGAGGACAGCRGTGTCAATA -3'

常見問題與解決方案