產品介紹

Frdbio®熒光染料為活性熒光染料，該系列包括從紫外、可見光譜到近紅外光譜常見熒光染料，用于標記生物分子，特別是蛋白質和抗體。對核心結構的創新性修改使得Frdbio®染料優于具有許多創新新穎特征的其他商業染料，主要表現在標記效率更高，發光度更強。

Frdbio®Cy5是一種熒光染料，其激發波長和發射波長分別為646nm和664nm，它與抗體形成更特異的抗體熒光素結合物，背景較更低。

基本原理

本試劑盒主要通過熒光素集團的活性鍵與生物分子的游離氨基共價結合，可以用于標記抗體，蛋白。本試劑盒種所提供的熒光染料都為預先活化干粉，便于長期保存，使用時用試劑盒隨帶的DMSO溶解便可直接用于標記實驗，60-90分鐘可以輕松完成標記。標記產物在含有防腐劑的保存液中可以保存在 4?C至少1個月以上，需要長期保存，則保存在-20℃。

本試劑盒常被用于抗體的直接標記，省卻了二抗的使用和其所帶來的操作步驟。

試劑盒組分

重要提示：

1. 本試劑盒所配置的活化Cy5熒光染料為干粉，可放置4?C或者-20?C長期保存，使用時加入試劑盒所配的DMSO溶解即可用于標記，溶解后的Cy5熒光染料不可保存下次使用，建議一次性使用完；

2. 本試劑盒所配置的超濾管默認截留30k MWCO,適合于抗體抗體，如果需要標記其他分子量蛋白類物質請與我們聯系，給您配置相應分子量截留超濾管（您的待標記物質分子量必須大于超濾管截留分子量的2倍以上）；

3. 本試劑盒所推薦的抗體標記量僅供參考，如有更高要求需要實驗者具體摸索優化，建議按照推薦最低量進行標記實驗。

4. 對待標記抗體、蛋白質的要求：

ü 待標記物以0.01M pH7.4 PBS環境為佳，不應含有甘油、BSA、疊氮鈉、氨基物質（包括甘氨酸、Tris 等），EDTA等物質。如果含有以上小分子物質，需用0.01M pH7.4 PBS 緩沖溶液進行充分透析、脫鹽柱脫鹽或者超濾管超濾置換溶液以除去干擾小分子，如果含有保護性蛋白BSA等需要想辦法將其分離去除；

ü 調整待標記物至適當的濃度，抗體調整的濃度為2-10mg/mL為宜；對于小分子物質需要實驗者摸索濃度，保證熒光素的比例過量。

ü 最佳標記反應條件為試劑盒所提供的標記緩沖液環境，盡可能在標記前將待標記物溶液環境置換為標記還緩沖液；

ü 如果待標記物溶液中有不溶物、有塊狀物或者沉淀請離心或者過濾除掉。

其他需要自備材料：

ü 待標記的生物分子

ü 移液器及吸頭.

ü 去離子水.

ü PBS (pH 7.4)

試劑盒儲存

試劑盒放在-20?C可保存6個月以上。.

試劑盒使用操作流程

Ø 試劑準備

待標記的生物分子與熒光素最佳摩爾比例為1:8~1:22,本試劑盒推薦最佳比例為1:15（按照本試劑盒操作熒光素干粉加入相應量DMSO溶解后的熒光素濃度770uM(nmol/ml),通常1mg/ml抗體(分子量150kDa)的濃度為6.67uM(nmol/ml)； 為了獲得最佳的摩爾比例，可以要通過預實驗進行摸索。以抗體標記為例，推薦量如下。最佳標記體系應保證抗體的濃度為2mg/ml，標記時終濃度不低于1mg/ml。對于其他標記量，參照表按等比例調整抗體的體積和用量。

Ø 樣品準備

待標記的分子濃度不低于2 mg/ml，如果濃度較低，需在實驗之前濃縮到2mg/ml以上；待標記的分子需要溶解在符合以下要求的緩沖液中，如果符合以下要求可以直接進行標記，如果不符合請將溶液置換（透析或者超濾）到符合要求的溶液中在進行標記實驗。

Ø 操作流程(以標記100ug抗體為例,2mg/ml)

1) 將待標記抗體溶液置換成標記緩沖液，或者加入1/10體積標記緩沖液，用移液器輕輕混勻；

2) 取20ul(按照抗體與熒光素摩爾比=1:23)活化的Cy5溶液加入到上述步驟混勻的抗體中，輕輕混勻，37℃ 避光反應1小時；

3) 反應完畢，將適量的PBS（約450uL）加入到步驟2)的混合溶液中，輕輕混勻并將溶液移至超濾管芯，4℃ 12000離心5min；

4) 離心完畢，取出管芯將外套管內溶液棄掉，管芯重新插入外套管，在管芯內重新加入適量的PBS（約450uL）4℃ 12000離心5min；

5) 重復步驟4）5次以上；

6) 將超濾管芯內溶液輕輕混勻并吹打管心內壁，并轉移到干凈避光離心管，此即為熒光素標記產物。

Ø 標記產物的保存

根據實驗需要調整到合適的濃度，可加入適量BSA，甘油及防腐劑等，分裝成小分-20℃避光保存；也可以將試劑盒附帶的標記物保存液與標記產物按照體積比1：1混勻后，即可分裝保存。