宏基因組測序及分析

一、技術介紹

宏基因組測序，是將環境樣品中的微生物群落基因組作為一個整體，進行高通量測序分析，從而對環境中微生物菌群的多樣性、豐度以及功能活性進行解讀，進而探求微生物與環境、微生物與宿主之間的關系；通過比較研究，發掘和研究新的、具有特定功能的基因等。

宏基因組測序，使我們對環境微生物的研究不再單純局限于純培養，可以對樣品中不可培養微生物進行更為全面的了解與探究，大大擴展了微生物的研究范圍，為微生物的研究提供了高效的研究工具。

?? 我們的Illumina測序平臺相對于454測序平臺具有更高的性價比，在相同的投入的情況下，采用Illumina可以得到更高的數據量，二這對于復雜的微生物群落而言意味著更高的覆蓋度，這有利于鑒定低豐度的微生物群落，也有利于挖掘更多的微生物基因資源。

二、技術路線

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圖1 宏基因組研究流程

三、生物信息學分析

1. 物種多樣性分析

? 將所得Reads質控后，與微生物基因組數據庫進行比對，得到樣品物種信息，分析出環境樣品中各個物種在總樣品物種中所占的比例。

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圖2 某環境樣品中微生物群落組成結構餅圖

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2. 微生物群落結構與功能分析

? 通過宏基因組大量測序，除了能得到樣品中的物種分類組成信息，還可以對測序數據進行功能基因分析，深度挖掘基因資源，研究與特定環境相關的代謝通路，以及通過不同樣品間的比較，研究微生物群落內部、微生物與環境、微生物與宿主間的相互關系。對于不同的樣品，可以進行相應的比較分析，以發現樣品間某些指標的異同。常用的數據庫有GO、COG、KEGG。

圖3 兩個不同時間環境樣品eggNOG 分析結果

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????????????? 圖4? 某環境樣品KEGG pathway 分析代謝路徑圖

四、應用領域

?? 人體及動物微生物：如人體皮膚、消化道、呼吸道、口腔以及動物瘤胃、昆蟲腸道等）；

?? 環境微生物：土壤、污水、海洋、礦地、火山口等；

?? 工業微生物：釀酒微生物、發酵微生物等；

?? 植物內生菌等

五、常見問題解答

? 1. 宏基因組測序對于樣品有什么要求？

1）對于基因組DNA樣品，一般要求OD_260/280在1.8-2.0之間，OD_260/230大于1.0，濃度>30ng/μl,總量>5μg，質檢結果顯示基因組DNA完整無降解。

2）對于PCR產物，需經電泳割膠回收，要求產物濃度>10ng/μl，總量>150ng，OD_260/280在1.8-2.0之間。

?? 2. 一般需要多少數據量？

對于不同的環境樣品，因其物種組成和豐度的不同，所需的數據量也有較大差異，一般而言，對于全基因組測序需要3G左右的數據量，對于16S rRNA基因可變區測序一般需要8M reads的數據量。

3. 實驗周期有多長？

?從收到樣品到文庫制備再到高通量測序，一般控制在20個工作日內完成，基本生物信息學分析一般能在30個工作日內完成，中高級生物信息內容一般60個工作日完成。

六、相關文獻

1. Elizabeth M Ross, Peter J Moate, Carolyn R Bath,et al. High throughput whole rumen metagenome profiling using untargeted massively parallel sequencing. BMC Genetics, 2012, 13: 53-66.

2. Zhu LF,Wu Q, Dai JY, et al, Evidence of cellulose metabolism by the giant panda gut microbiome. PNAS, 2011, 108(43): 17714-17719. 3. Qin JJ, Li YR, Cai SH, et al. A metagenome-wide association study of gut microbiota in type 2 diabetes. Nature, 2012, 490: 55-60. 4. Qin JJ, Li RQ, Raes J, et al. A human gut microbial gene catalogue established by metagenomic sequencing. Nature, 2010, 464: 59-67.