性能

將檢測和定量基因突變整合入一個強有力的體系，使用焦磷酸測序技術，相較于其他基于測序的方案在分析靶向短鏈DNA序列時，PyroMark平臺表現更卓越。在表觀遺傳學研究中分析甲基化狀態，焦磷酸測序技術可高重復性的定量甲基化頻率，包括單個或連續的CpG位點，并可檢測和定量甲基化水平的微小變化。

對于遺傳檢測應用，焦磷酸測序技術可準確定量等位基因的可變位點，且很容易解決雜合性問題。 對于微生物鑒定和抗性分型，焦磷酸測序技術能夠同時分析多個樣本的常見的藥物抗性突變的。

原理

焦磷酸測序技術基于邊合成邊測序的原理，數分鐘內可獲得定量數據。PyroMark Q96 ID是提供實時序列信息的完整體系，高度適用于檢測遺傳變異、遺傳定量和短鏈DNA測序。以下的產品可配合PyroMark Q96 ID儀器使用：PyroMark Q96 Vacuum Workstation、PyroMark CpG SW、PyroMark Assay Design SW、PyroMark IdentiFire SW、PyroMark Gold Q96 Reagents和PyroMark Control Oligo。同時提供樣本制備方案，可使用PyroMark Q96 Vacuum Workstation制備單鏈DNA。

焦磷酸測序反應步驟：

步驟1：擴增DNA片段，作為焦磷酸測序模板的單鏈是生物素標記的。變性后，分離生物素標記的單鏈PCR擴增子，與測序引物雜交。雜交的引物和單鏈模板同各種酶一起孵育，包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶以及底物腺苷酰硫酸（APS）和熒光素。

步驟2：第一個脫氧核苷三磷酸（dNTP）加入反應中，在DNA聚合酶的作用下，dNTP結合到DNA鏈上與其互補的堿基位。每次結合都會釋放與核苷酸相等摩爾量的焦磷酸（PPi）。

步驟3：在有APS的條件下，ATP硫酸化酶將PPi轉化為ATP。在這個ATP的驅動下，熒光素酶將熒光素轉化為氧化熒光素，并產生可見光，可見光的量與ATP的量成正比。通過電荷耦合（CCD）相機即可檢測到熒光素酶催化反應產生的可見光，并在原始數據輸出（Pyrogram）中顯示為一個峰，每個峰的高度（光信號）與結合的核苷酸數量成正比。

步驟4：三磷酸腺苷雙磷酸酶，是一種核苷酸降解酶，會降解未結合的核苷酸與ATP。完全降解后，加入另一個核苷酸。

步驟5：持續添加dNTP。α-硫代脫氧腺苷三磷酸（dATPαS）在反應中用于替代天然脫氧腺苷三磷酸（dATP），這是因為DNA聚合酶可高效的應用前者，而不被熒光素酶識別。當該過程連續進行時，就會形成互補的DNA鏈，可根據Pyrogram追蹤的信號峰確定核苷酸序列。

簡化的工作流程—從樣本到結果

多功能PyroMark Q96 ID與表觀遺傳和遺傳分析流程無縫接合，且與QIAGEN先進的樣本制備、亞硫酸氫鹽轉化和PCR擴增技術兼容。借助于高度可靠的儀器可在序列水平上對SNP、插入和缺失、CpG位點的檢測以及生成序列信息。簡化的工作流程可更快速地獲得結果。

快速方便的樣本制備

從PCR產物到直接用于測序的單鏈模板，應用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內同時制備96個樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時間少于5分鐘。

流程

快速方便的樣本制備

從PCR產物到直接用于測序的單鏈模板，應用PyroMark Q96 Vacuum Workstation可在15分鐘內同時制備96個樣本。該工作站操作簡單，且手工操作時間少于5分鐘。

在焦磷酸測序之前，形成了一個生物素標記的PCR產物，該產物結合到覆蓋鏈酶親和素的瓊脂糖凝膠珠上。這些膠珠會被真空儀器捕捉并徹底清洗，隨后變性，得到適合于焦磷酸測序的單鏈DNA。該模板DNA放入含測序引物的焦磷酸測序反應板中，隨后引物退火，再將該板放入PyroMark儀器中即可。PyroMark Gold試劑包含用于焦磷酸測序反應的酶、核苷酸和底物，將這些試劑移入分配卡夾，按照軟件中提供的體積試被加入儀器中，用于焦磷酸測序。

應用

焦磷酸測序技術對各個領域的研究應用至關重要。PyroMark Q96 ID能夠靈敏的分析遺傳學和表觀遺傳學的變化，如檢測病原體中藥物抗性的發展，基因表達調控中表觀遺傳學DNA甲基化的作用、牲畜的特異表型的遺傳標記，以及法醫檢材樣本中線粒體DNA的多態性。此外，由于焦磷酸測序技術整合了序列檢測和定量，提高了分析靈敏度，有助于發現新的信息。

軟件

易于使用的PyroMark Q96軟件

PyroMark Q96軟件能夠全面分析您的結果。最近更新的軟件包含四個分析程序：AQ（等位基因定量）、SNP（分析SNP和InDel）、CpG（甲基化分析）和SQA（序列鑒定）。這四個不同類型的程序可在同一塊板上同時分析樣本。

使用PyroMark Assay Design Software，靈活、簡單的設計焦磷酸測序實驗

PyroMark Assay Design Software 2.0實現輕松的PCR和測序引物的設計。這些產品是經過優化的，可用于所有的PyroMark儀器。