掃描電鏡/透射電鏡/激光共聚焦

掃描電鏡

掃描電鏡取材要求：

由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術是最基本、最常用的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。

小提示：

透射電鏡標本先應用超薄切片機（Ultrotome）進行切片，再經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。

掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。

透射電鏡

透射電子顯微鏡在材料科學、生物學上應用較多。由于電子易散射或被物體吸收，故穿透力低，樣品的密度、厚度等都會影響到最后的成像質量，必須制備更薄的超薄切片，通常為50～100nm。所以用透射電子顯微鏡觀察時的樣品需要處理得很薄。

常用的方法：超薄切片法、冷凍超薄切片法、冷凍蝕刻法、冷凍斷裂法等。對于液體樣品，通常是掛預處理過的銅網上進行觀察。

樣本制備方法：

由于電鏡電子束穿透能力的限制，必須把標本切成厚度小于0.1um以下的薄片才適用，這種薄片稱為超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
??? 在透射電鏡的樣品制備方法中，超薄切片技術是最基本、最常用的制備技術。超薄切片的制作過程基本上和石蠟切片相似，需要經過取材、固定、脫水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步驟。
取材的基本要求
組織從生物活體取下以后，如果不立即進行適當處理，會由于細胞內部各種酶的作用，出現細胞自溶現象。此外，還可能由于污染，微生物在組織內繁殖使細胞的微細結構遭受破壞。因此，為了使細胞結構盡可能保持生前狀態，必須做到快、小、準、冷：
(1)．動作迅速，組織從活體取下后應在最短時間內(爭取在1分鐘內) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取組織的體積要小，一般不超過1mm×1mm×1mm。也可將組織修成1mm×1mm×2mm大小長條形。因為固定劑的滲透能力較弱，組織塊如果太大，塊的內部將不能得到良好的固定。
(3)．機械損傷要小，解剖器械應鋒利，操作宜輕，避免牽拉、挫傷與擠壓。
(4)．操作最好在低溫(0℃～4℃)下進行，以降低酶的活性，防止細胞自溶。
(5)．取材部位要準確。
取材方法：將取出的組織放在潔凈的蠟版上，滴一滴預冷的固定液，用兩片新的、鋒利的刀片成“拉鋸式”將組織切下并修小，然后用牙簽或鑷子將組織塊移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果組織帶有較多的血液和組織液，應先用固定液洗幾遍，然后再切成小塊固定。

免疫熒光染色

主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結合，其次是帶有熒光基團的二抗識別并結合一抗，在激光共聚焦系統下即可觀察到熒光。染色程序分為兩步，第一步，用已知未標記的抗體（Anti LC3II）加到未知抗原樣本上；第二步，加上熒光標記的抗球蛋白抗體或抗IgG、IgM抗體（Anti Alexa Fluor 647）。如果第一步發生了抗原抗體反應，熒光標記的抗球蛋白抗體就會和已結合抗原的抗體進一步結合，從而可鑒定抗原。

我公司可以提供單標、雙標及三標的免疫熒光服務。

激光共聚焦

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope）用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統經一次調焦，掃描限制在樣品的一個平面內。調焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結構。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用于觀察細胞形態，也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。

高內涵活細胞成像

高內涵細胞成像分析系統由三個部分組成：全自動高速顯微成像，全自動圖像分析和數據管理。全自動高速顯微成像在短時間內生成大量的圖像，全自動圖像分析從這些圖像中提取大量的數據，數據管理軟件負責建檔存儲、注釋比較、檢索分享這些圖像和數據。

高內涵技術最初應用于藥物篩選，隨著技術的進步和發展，近年來在生命科學研究中得到了廣泛的應用，包括細胞信號通路，腫瘤學，神經生物學，免疫學，傳染病學，干細胞的研究等等。HCA提供的信息不可能從傳統方法中獲得，很多實驗用高內涵平臺來完成，比現有的方法更靈敏，通量更高，成本更低，結果更準確和可靠。

其中高內涵篩選(HCS)是一套自動化分析方法，利用整合的顯微鏡、圖像處理技術及可視化工具從細胞或細胞群中提取數據，獲得定量分析結果。HCS一般應用于高通量的樣品熒光成像，提供定量分析結果。此外，HCS能夠結合單個細胞的多重檢測結果，同時分析單次實驗中的多個細胞亞群。

高內涵篩選的技術優勢：

• 高內涵篩選可在保持細胞結構和功能完整性;
• 同時檢測被篩樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導等各個環節的影響;
• 在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。

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