喹乙醇代謝物(MQCA)檢測
試劑盒說明書
【概述】
喹乙醇又稱喹酰胺醇，商品名為倍育諾、快育靈，由于喹乙醇有中度至明顯的蓄積毒性，對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在的三致性，即致畸形，致突變，致癌。因此喹乙醇在美國和歐盟都被禁止用作飼料添加劑。《中國獸藥典》(2005版)也有明確規定，喹乙醇被禁止用于家禽及水產養殖。水產品喹乙醇限量標準值:0μg/kg。喹乙醇若添加于牛、羊、豬、雞飼料中，亦能夠促進畜產類生長及蛋白質同化、提高飼料利用率和增加瘦肉率。但若遭到濫用，將造成細菌耐藥性增加，當人類食用或接觸被抗生素污染的禽肉就可能感染具耐藥性的細菌，進而危害健康。
動物食用喹乙醇藥物（OLA)后，大部分的喹乙醇（OLA)會代謝為喹乙醇代謝物（MQCA)，僅有30%左右的喹乙醇殘留在組織中。因此，一般用“喹乙醇的原藥（OLA）試劑盒”檢測飼料中的喹乙醇；而用“喹乙醇代謝物（MQCA)試劑盒”檢測動物源性食品中的喹乙醇代謝物殘留。
【原理】
本試劑盒是應用 ELISA 技術研發而成的檢測產品，采用間接競爭一步法。在酶標板中同時加入校準品（或樣本）、酶結合物及抗體，酶標板上包被的抗原與加入的校準品（或樣本）中的抗原競爭結合加入的抗體，同時酶結合物與抗體結合。用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其殘留物喹乙醇代謝物濃度呈負相關，與校準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣本中喹乙醇代謝物的含量。

【適用范圍】
可定性、定量檢測動物組織（雞、魚、蝦等）中喹乙醇代謝物的殘留量。
【試劑盒特性】
（一）基本特性：
靈敏度0.5ppb
線性范圍0.5~40.5ppb
操作時間50min（二）樣本最低檢測限：
方法（組織）1ppb
（三）交叉反應率：
喹乙醇代謝物(MQCA）100%
（四）準確度：
A、雞肉、魚肉、蝦肉80%~120%
B、雞肉、魚肉、蝦肉80%±15%
組   織.  60%-120%
（五）精密度：
本試劑盒板內、板間變異系數<10%
【試劑盒組成】
1. 96孔酶標板： 包被有偶聯抗原     1塊
2.標準液×6瓶（1ml/瓶）： 0ppb、0.5ppb、1.5ppb、4.5ppb、13.5ppb、40.5ppb
3.高濃度標準品（1ml/瓶） 100ppb
4. 酶結合物 7ml 紅色帽
5. 抗體工作液 7ml 藍色帽
6. 底物A液 7ml 紅色帽
7. 底物B液 7ml 黑色帽
8. 終止液 7ml 黃色帽
9. 20X濃縮洗滌液 50ml 透明帽
10. 2X濃縮復溶液 50ml 透明帽
11. 蓋板膜  2張
【需自備的設備及試劑】
設備：微孔板酶標儀450nm/630nm；旋轉蒸發儀/氮氣吹干裝置；均質器；振蕩器；渦旋；離心機；天平：感量0.01g刻度10ml移液管；洗耳球；量筒；10ml玻璃試管；50ml聚苯乙烯離心管。 
微量移液器：單道 20l～200l、100l～1000l
多道 250l
試劑：乙酸乙酯(分析純)；正己烷（或正庚烷）(分析純)；去離子水；濃硫酸；氫氧化鈉(分析純)；濃鹽酸(分析純)。
【樣本前處理步驟】
（一）樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必須使用潔凈實驗器具，以避免污染干擾實驗結果。
（c）未處理的樣本冷凍保存。
（d）處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時。
（e）鹽酸溶液可于室溫保存三個月。
（f）氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個月。
（二）樣本前處理方法
A、組織（雞、鴨、魚、蝦等生鮮、肝臟）
1、稱1±0.05g 均質過的組織樣本于50ml離心管中；加入8ml乙酸乙酯和1ml水，振蕩 5min，再加入1ml 2M硫酸（配液2），振蕩30s；4000r/min以上，25℃離心5min；
2、取 4ml清澈有機相至玻璃試管中，50-60℃氮氣或空氣吹干；
3、加入正己烷1ml,渦旋振蕩30s，再加入1ml樣本復溶液，振蕩混合 30s，2000r/min 25℃離心5min；
4、取下層50l液體用于分析。樣本稀釋倍數: 2倍 
B、組織（雞、鴨、魚、蝦等生鮮）
1、準確稱取組織樣2.00±0.05g于50mL離心管中，加入4mL提取液（配液6），在渦旋振蕩器上振蕩5min，4000r/min離心10分鐘。
2、取上清1mL加入5～10μl 5MNaOH中和至中性，震蕩30s混勻。
3、取50uL用于檢測。 
樣本稀釋倍數：2倍
【試劑的配制】
配液1：樣品復溶液：把濃縮復溶液（2×）按1份濃縮復溶液+1份去離子水稀釋。用于提取樣本的復溶，樣品復溶液在4℃環境下可保存一個月。
配液2：2M硫酸：把濃硫酸稀釋9倍（即80ml水中+10ml濃硫酸即可）
配液3：洗滌工作液：用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋（1份20×濃縮洗滌液+19份去離子水）用于酶標板的洗滌，洗滌工作液在4℃環境可保存一個月。
配液4：5M 氫氧化鈉：稱取20.0g氫氧化鈉加去離子水溶解后定容至100mL即可。
配液5：0.1M鹽酸：835μl濃鹽酸加入到99.16ml去離子水即可。
配液6：提取液：配制100mL0.1mol/LHCL，加入2.5gNaCL，混勻，倒出10mL，再加入10mL甲醇，混勻即可。
【檢測步驟】
（一）檢測前須知：
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。
（二）具體操作步驟：
1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
5、加標準品/樣品：加校準品/樣本50μL/孔到各自的微孔 中，然后加入酶結合物50μL/孔，再加入抗體工作液50μL/孔，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環境反應30min。
6、洗板：取出微孔板，甩出孔內液體，用洗滌工作液按250μL/孔洗板4 次，每次浸泡30 秒，在吸水紙上拍干。
7、顯色：加入底物A液50l/孔，再加底物B液50l/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃環境中反應15min（見注意事項8）。
8、測定：加入終止液50l/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據），測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止液用目測法可進行判定)。
【結果判定】
結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與喹乙醇代謝物的含量成負相關。
1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。例如樣本1的吸光度值為0.236，樣本2的吸光度值為0.666，標準品吸光度值分別是： 0ppb為1.949；0.5ppb為1.434；1.5ppb為0.939；4.5ppb為0.487；13.5ppb為0.157；40.5ppb為0.060。則樣本1的濃度范圍是4.5ppb-13.5ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中喹乙醇代謝物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是1.5ppb-4.5ppb再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中喹乙醇代謝物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算 
標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標準（0標準）的吸光度值，再乘以100%，即

B標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B00ppb標準溶液的平均吸光度值
（2）標準曲線的繪制與計算
以標準品百分吸光率為縱坐標，以喹乙醇代謝物標準品濃度（ppb）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中喹乙醇代謝物的實際濃度。
若利用試劑盒專業分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（歡迎來電索取）
【注意事項】
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
6、儲存條件：保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質的跡象：發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時，表示試劑可能變質。
8、在加入底物A液和底物B液后，一般顯色15min即可。若顏色較淺，可延長反應時間到20min（或更長），但不得超過30min。反之，則減短反應時間。
【儲藏條件及保質期】
1、儲藏條件：本試劑盒于 2～8℃保存，勿冷凍。
2、保 質 期：本產品有效期為 12 個月，生產日期見包裝盒。