產品詳情
產品介紹
許多生化反應，例如ATP水解、DNA和RNA聚合、腺苷酸環化酶形成的環AMP和脂肪酸的酶促活化以形成它們的輔酶A酯，都能產生焦磷酸鹽(PPi)，PPi能被無機焦磷酸酶水解。翌圣焦磷酸(PPi)熒光檢測試劑盒采用最可靠的焦磷酸鹽分光光度測定方法，使用專有的熒光PPi感受器(Ex/Em=316/456 nm)測定樣本PPi的含量，相對于傳統的酶偶聯方法更簡單、更穩定，是篩選酶活性或酶抑制劑的理想方法。

該試劑盒已經成功用于高通量篩選，適用于多種樣本，如：尿液、血清、血漿、細胞培養提取物、組織裂解物等。

產品特色
產品組分

組分編號 組分名稱 組分規格
50115-A Assay Buffer 25 mL×1
50115-B PPi Sensor (Lyophilized) 1 vial
50115-C Pyrophosphate Standard 1 mL×1, 50 mM
50115-D DMSO 200 μL×1

注意事項

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
粉末溶解前請先短暫離心，以保證產品全在管底。
請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。
本產品僅用于科研用途。

應用案例
實驗過程

1、試劑準備

① 200× PPi Sensor母液：將50 μL DMSO（D組分）加入PPi Sensor (Lyophilized)（B組分）中制備200× PPi Sensor母液，分裝-20°C避光保存，避免反復凍融。25 µL 200× PPi Sensor母液足以用于一塊96孔板。

② PPi標準液(1 mM)：向10 μL的50 mM焦磷酸鹽標準溶液（C組分）加入490 μL ddH2O或50 mM Hepes緩沖液(pH 7)，得到1 mM PPi標準溶液。

③ PPi標準液(PS7 - PS1)：向50 μL的1mM焦磷酸鹽標準溶液加入450 μL ddH2O或50 mM Hepes緩沖液(pH 7)，得到100 μM PPi標準溶液(PS7)。取100 μM PPi標準溶液，用ddH2O或50 mM Hepes緩沖液(pH 7)進行1：3連續稀釋，得到連續稀釋的焦磷酸鹽標準品(PS6-PS1)。

④ PPi Sensor工作液：25 μL的200× PPi Sensor母液加入5 mL的Assay Buffer（組分A，用前恢復至室溫），充分混合以制備PPi工作液。

【注】：由于該檢測方法對PPi具有高靈敏度，因此必須使用不含PPi的實驗室器具和試劑。DTT ≥ 1 mM會增加背景，MgCl2 ≥ 2 mM會抑制反應。

2. 根據表1和2中提供的布局向黑色96孔板中加入50 μL PPi標準品(PS)、空白對照品(BL, Assay buffer only)或測試樣本(TS)。對于384孔板，每孔加入25 μL。

【注】：建議尿液樣品可考慮稀釋1-10倍，血清和血漿樣品可考慮稀釋2-20倍后再進行檢測，具體稀釋倍數根據具體實驗情況而定。

Table 1. Layout of Pyrophosphate standards and test samples in a solid black 96-well microplate.

Table 2. Reagent composition for each well.

3. 對于96孔板，每孔加入50 μL PPi Sensor工作液，總測定體積為100 μL/孔；對于384孔板，每孔加入25 μL PPi工作液，總測定體積為50 μL/孔。

4. 混勻后，室溫孵育10-30 min。

5. 熒光酶標儀下測量熒光讀值，Ex/Em = 316/456 nm (Cutoff = 420 nm)。

數據分析

從空白標準孔獲得的讀數用作陰性對照。從其他標準的讀數中減去該值，以獲得基線校正值。然后，繪制標準讀數以獲得標準曲線和方程。該方程可以用于計算樣本中PPi含量。

【注】：熒光背景會隨時間而增加，因此標準品和測試樣本的熒光讀值計算前需減去空白孔的熒光強度值。

圖1 代表性PPi標準曲線

存儲條件
冰袋運輸。-25~-15℃避光保存，有效期2年。

FAQ
Q：探針只與PPi結合嗎？

A：探針會和一些其它物質結合，如ATP或一些和PPi結構相近的，但親和力不強。所以在選擇配置樣本的buffer要謹慎選擇，建議一般是HEPES溶液。

Q：如果緩沖液中有大于2 mM的MgCl2，抑制的是哪部分反應？

A：Mg2+會抑制PPi和探針的結合。

Q：如何保證實驗器具和試劑不含PPi？

A：實驗器具清洗干凈就可以，或者使用一次性實驗器具。

Q：如果樣本體系中本身含有大于1 mM DTT和大于2 mM的MgCl2，可以將體系稀釋后再進行檢測嗎？

A：體系可以稀釋，但是同時要注意謹慎選擇稀釋液，并且稀釋后樣本中PPi濃度不要太低，要在檢測范圍之內。

Q：血漿和血清都可以檢測嗎？

A：血清和血漿都可以用，但血漿中含有EDTA，如果EDTA> 30 μM會影響探針和PPi結合效率。

Q：RIPA裂解液提取的樣本能用這個試劑盒嗎？

A：SDS、Tween-20和EDTA (> 30 μM)都會影響探針和PPi結合，而RIPA裂解液中含有SDS，故不適合。

Q：樣本裂解液中TritonX-100的濃度多少合適？

A：TritonX-100的濃度可以達到1%。

Q：細胞和組織樣本如何處理？

A：可以使用HEPES溶液或者HBSS進行勻漿，離心后取上清進行檢測。細胞樣本也可以使用溫和裂解液，但裂解液中不能含有SDS、Tween-20或其它影響探針和PPi結合的物質。

Q：試劑盒PPi的檢測范圍是多少？

A：0.1-10 μM。

Q：為什么做出來的標曲和說明書上的不一樣？

A：實驗室需做復孔，注意復孔數據是否一致，去除差異大的數據；作圖時橫坐標取PPi濃度的log10值；

Q: 想請問一下，這標準曲線的縱坐標就是熒光酶標儀示數減去空白示數嗎。還有最終得到的標曲應該是線性的還是像咱們網站上一樣是非線性的呢? 還有這個%of control是指什么?

A: 1.標準曲線的縱坐標就是熒光酶標儀示數減去空白示數；2.這個試劑盒得到的標準曲線應該是非線性的，因為PPi Sensor與PPi的結合是一個飽和過程，當PPi的濃度越高時，熒光強度的增加越小。3. 圖中的% of control是指每個樣品的熒光強度與空白對照的百分比，用于表示樣品中PPi的相對含量?？瞻讓φ帐侵患尤朐噭┖兄械木彌_液和PPi Sensor，不加入任何樣品或標準品。

Q：說明書寫的是1：3進行稀釋，PS7-PS1的濃度時0.13-100uM，是怎么稀釋的呢？

A：三倍稀釋，比如1：100稀釋，是稀釋100倍，1：3稀釋是稀釋3倍，PS7-PS1濃度分別是：100uM，33.33uM，11.11uM，3.7uM，1.23uM，0.41uM，0.13uM。

Q：cutoff是必須的嘛？

A：不是必須的，建議有條件的話，cutoff是要設置的，cutoff值是指熒光檢測儀器的濾波器設置，用于減少背景信號和提高信噪比。不設置，可能會影響您對實驗結果的判斷，如果您是初次使用這類試劑盒或初次進行這類檢測，該值的設置，是結果準確性判斷的直接有效的方法。

Q：焦磷酸試劑盒可以檢測大腸桿菌提取的蛋白樣品嗎？

A：可以。

Q：這個試劑盒檢測一定要用黑色的酶標板嗎？

A：黑色孔板可以減少光的散射和反射，提高熒光信號的靈敏度和準確度。有條件的話，建議使用黑色的。其他的也可以，但是可能會影響熒光強度。

Q: 檢測反應體系的最適pH范圍是多少？

A: 50115的檢測反應體系中允許的pH范圍是6.5-8.0，最適范圍是pH 7.0-7.4。