?侵襲小室實驗

摘要： 在A549細胞中過表達human Oct-4基因，通過對Oct-4過表達細胞組、空細胞組與陰性對照組進入下室的細胞數量進行測定，研究Oct-4基因對細胞遷移能力的影響。實驗結果顯示Oct-4基因可以促進A549細胞的遷移能力。為進一步深入研究Oct-4基因的功能提供實驗數據。
關鍵詞：Oct-4，Transwell， A549，細胞遷移

一、?實驗原理
Transwell小室底層的一張有通透性的膜（一般為聚碳酸酯膜），將其放置于孔板中，小室內稱上室，培養板內稱下室。由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞。應用Transwell可研究下層培養液中的成分對細胞生長、運動等的影響。
腫瘤遷移實驗：研究腫瘤細胞的遷移能力或特定情況下腫瘤細胞的遷移能力。常用8.0、12.0μm膜，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，腫瘤細胞會向營養成分高的下室跑，計數進入下室的細胞量可反映腫瘤細胞的遷移能力。
腫瘤侵襲實驗：研究腫瘤細胞的侵襲能力或特定情況下腫瘤細胞的侵襲能力。在聚碳酸酯膜上涂上一層基質膠，模仿細胞外基質，上室種腫瘤細胞，下室加入FBS或某些特定的趨化因子，細胞要把基質消化后才可以從上室遷移到下室，計數進入下室的細胞量測定細胞的侵襲能力。

二、?實驗目的
用質粒Oct-4-EGFP轉染后的A549細胞與正常細胞組、陰性對照組進行比較分析，考察基因Oct-4對A549細胞的遷移能力產生的影響。

三、?實驗步驟
實驗共分以下4個主要步驟：

1.?質粒轉染細胞：
準備A549細胞，轉染前一天按照70-80%密度鋪在6cm培養皿中。16h后，按照轉染試劑說明書轉染細胞 （8μg質粒，20μl和元生物轉染試劑）。
2.?Transwell鋪板：
1)?轉染12h后，胰酶消化，收集細胞： 細胞計數后，每個樣品準備1×106 cells/ml。
2)?1,200rpm離心5min后，重懸浮于1ml無血清培養基。
3)?濕潤小室：將300μl預熱的無血清培養基加入到小室中，常溫放置1~2h，將ECM膜濕潤。
4)?將小室中的培養基去掉，24孔板中，沒有小室的孔中加入500μl含10%血清的培養基。
5)?用鑷子將小室輕輕放入預先加好培養基的孔中，盡量避免產生氣泡。
6)?每個樣品取300μl，加入到小室中，即3×105 cells加入到小室中，37℃，5% CO2培養箱中培養。
3.?細胞培養及染色：
1)?培養箱中培養72h后，取出小室。
2)?用棉棒將小室內的細胞和培養基去掉。
3)?24孔板中，沒有小室的孔中滴入15滴染色液（約500μl）。
4)?用鑷子將小室輕輕放入預先加好染色液的孔中，盡量避免產生氣泡。
5)?常溫放置20min，進行染色。
6)?用去離子水洗3-5次，將背景洗掉。
7)?小室內邊緣殘留的細胞會影響實驗結果，用棉棒擦干。
4.?統計分析：
顯微鏡下拍照，使用Image-Pro Plus軟件進行細胞計數。

四、?實驗結果

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?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. 過表達Oct-4對A549細胞遷移能力的影響

????????????????????????????????????? 從左開始依次為A549空細胞組，NC對照組（過表達EGFP），實驗組（過表達Oct-4-EGFP），每組實驗均重復3次

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???????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖2. 過表達Oct-4對A549細胞遷移能力影響的統計分析
????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? **表示p<0.01

結論：從實驗結果以及進入小室的細胞的數量統計分析可以發現，A549細胞在過表達Oct-4-GFP 72h以后，遷移能力均高于空細胞組以及對照組（p<0.01）。

五、?參考文獻
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