革蘭氏陽性菌質粒大量提取試劑盒

產品內容：?

? ? ? ??使用前請先在漂洗液中加入無水乙醇，加入體積請參照瓶體上的標簽。溶液Ⅰ在使用前先加入 RNaseA（將試劑盒中提供的 RNaseA 全部加入） ，混勻，置于 2-8℃保存。如非指明，所有離心步驟均為使用臺式離心機在室溫下離心。?

操作步驟： ??

1、取 50-200ml ?細菌培養物，11000rpm 離心 5min，盡量吸除上清（菌液較多時可以通過多次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中）。 ?

2、向留有菌體沉淀的離心管中加入 5ml ?溶液Ⅰ和 1ml ?溶菌酶，混勻。37℃水浴 30 min ?以上（根據菌液量可適當加長水浴時間，請先檢查溶液Ⅰ是否已加入 RNaseA），使用移液器或旋渦振蕩器徹底懸浮細菌細胞沉淀。

注意：如果菌塊未徹底混勻，會影響裂解導致質粒提取量和純度偏低。 ?

3、向離心管中加入 5ml ?溶液Ⅱ，溫和地上下翻轉 6-8 ?次使菌體充分裂解。注意：混勻一定要溫和以免污染基因組 DNA，此時菌液應變得清亮粘稠，作用時間不要超過 5 min，以免質粒受到破壞。 ?

4、向離心管中加入 7ml ?溶液Ⅲ，立即溫和地上下翻轉 6-8 ?次， 充分混勻，此時會出現白色絮狀沉淀。 11000rpm離心 10 min ?，用移液器小心地將上清轉移到另一個干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。注意：溶液Ⅲ加入后應立即混勻，避免產生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清。 ?

5、將上一步所得上清液加入吸附柱中（吸附柱加入收集管中），室溫放置 2min，11000rpm ?離心 2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中( ?如果一次加不完，可分兩次吸附) ?。 ?

6、向吸附柱中加入 8ml ?漂洗液( ?使用前請先檢查是否已加入無水乙醇) ?，11000rpm離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 ?

7、向吸附柱中加入 6ml ?漂洗液，11000rpm離心 2min，棄廢液，將吸附柱放入收集管中。 ?

8、11000rpm 離心 5min，將吸附柱敞口置于室溫或 50℃溫箱放置數分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中的乙醇會影響后續實驗如酶切、PCR ?等。 ?

9、將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜中央懸空滴加 1-2ml ?經 65℃水浴預熱的洗脫液，室溫放置5min，11000rpm離心 2min，收集質粒DNA溶液。 ?

10、（可選）為了增加質粒的回收率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置 5min， 11000rpm離心 2min。 ??

注意事項： ??

1、使用前請先檢查溶液Ⅱ和溶液Ⅲ是否出現混濁，如有混濁現象，可在 37℃水浴中加熱幾分鐘，待溶液恢復

澄清后再使用。 ?

2、洗脫緩沖液體積不應少于 500ul，體積過小影響回收效率；洗脫液的 pH ?值對洗脫效率也有影響，若需要用水做洗脫液應保證其 pH 值在 8.0 左右( ?可用 NaOH ?將水的 pH 值調至此范圍) ?，pH 值低于 7.0 會降低洗脫效率。DNA產物應保存在-20 ℃，以防 DNA降解。 ?

3、如果所提質粒為低拷貝質粒或大于 10kb 的大質粒，應加大菌體使用量，使用 400-800ml 過夜培養物，同時比例增加溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的用量，吸附和洗脫時可以適當的延長時間，以增加提取效率。 ?

4、 DNA濃度及純度檢測：得到的質粒DNA純度與樣品保存時間、操作過程中的剪切力等因素有關。得到的DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測濃度與純度。DNA應在OD260處有顯著吸收峰， OD260 ?值為 1 ?相當于大約 50 ?μg/ml ?雙鏈DNA、40 ?μg/ml ?單鏈DNA。OD260/OD280比值應為 1.7-1.9 ?，如果洗脫時不使用洗脫緩沖液，而使用去離子水，比值會偏低，因為pH值和離子存在會影響光吸收值，但并不表示純度低。

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