產品簡介

2×Color qPCR Fluore Green Master Mix (High Rox)是2×實時定量PCR擴增預溶液，熒光強度高，靈敏度高和特異性強，擴增產量高。核心組分Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增；還添加了提升PCR反應擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進因子，使定量PCR可以在寬泛的定量區域內獲得良好的線性關系。

本產品利用不同染料的混合變色反應來監控移液操作，有效減少了移液誤差的發生。

產品信息

組分信息

儲存條件

-25~-15℃避光保存，有效期1年。

注意事項

1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

2. 解凍后Master Mix可能出現絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。

3. 使用前請上下顛倒以混勻Master Mix，請勿vortex避免產生氣泡，影響定量結果。Master Mix經混勻短暫離心后即可使用。加樣過程中吹打要輕，如果操作不慎Master Mix起泡，需再次離心方可使用。

4. 由于本品檢測靈敏度極高，易被空氣中氣溶膠污染。因此反應體系配制時請于超凈工作臺內進行，配制過程中請使用滅菌槍頭、反應管，條件容許的實驗室推薦使用專用的移液槍和帶濾芯的槍頭。

5. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（Cat#N132062），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。

6. 本產品僅用于科研。

使用說明

1. 模板處理

2× Color qPCR Fluore Green Master Mix (High Rox)中包含藍色染料，10×Dilution Buffer為專用黃色濃縮模板稀釋液。使用過程中，如需要進行模板示蹤，則需稀釋到1X作為模板稀釋液使用，然后進行qPCR檢測；如不需要進行模板示蹤，則不使用Dilution Buffer即可。

【注】：*實際使用過程中也可按需使用其他方案，保證最終模板中Dilution Buffer濃度為1×即可。

2. 推薦qPCR反應體系

【注】：

*通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。

**如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10，最佳模板加入量以保證擴增得到的Ct值在20-30個循環為宜。

***推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性；上機前需充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。

3. 反應程序

【注】：

*退火溫度和時間：請根據引物TM值和目的基因的長度進行調整。

**熒光信號采集：請勿忘記打開熒光信號采集，按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置。

***熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。

4. 引物設計指南

1) 推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。

2) 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。

3) 引物堿基分布均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。

4) 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。

5) 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物 3’端有2個堿基以上的非特異性互補。

6) 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。

5. 適用機型

本產品中預混了用以校正孔與孔之間熒光信號誤差的ROX Reference Dye 1 (高濃度)，適用于以下熒光定量PCR儀：

Applied Biosystems 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOnePlus;

以及其他需要添加高濃度ROX Reference Dye的熒光定量PCR儀。