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濃度：5U/ul

貨號：GWP100

有效期：24個月

保存條件：-20℃

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產(chǎn)品簡介：

GsmartI pfu DNA Polymerase適用于對PCR產(chǎn)物保真性要求高的實驗，即便使用困難模板該酶也能精確快速的進(jìn)行PCR擴(kuò)增。GsmartI pfu DNA Polymerase的高保真性使其成為克隆的最佳選擇。該酶具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，3-5外切酶活性可以在聚合反應(yīng)中糾正錯誤參入的堿基，使其具有較高的保真性，該酶不僅適合擴(kuò)增端片段序列也適合擴(kuò)增長片段序列，該酶PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為平末端，可以直接進(jìn)行平末端克隆。

主要應(yīng)用：

• 高保真PCR擴(kuò)增
• 擴(kuò)增DN**段用于基因表達(dá)克隆
• 擴(kuò)增DN**段可用于平末端連接
• 基因定點突變

?擴(kuò)增能力：

• 延伸速度為2kb/min
• 簡單模板，如以λDNA為模板，可以有效擴(kuò)增不超過12kb片段（≤12kb）
• 復(fù)雜模板，如以人基因組為模板，可以游俠擴(kuò)增不超過3kb片段（≤3kb）

活性單位定義：

用活化的大馬哈魚精子DNA做模板，74℃ 30min內(nèi)攝入10nmol全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為一個活性單位，即1U。

注意事項：

• 推薦退火溫度為引物Tm值－5℃；
• 延伸速度1-2kb/min；
• 50ul體系中GsmartI Pfu DNA Polymerase的用量為2.5 U；
• 使用dNTP，dUTP將導(dǎo)致PCR失敗；
• GsmartI Pfu DNA Polymerase產(chǎn)生平末端DNA產(chǎn)物；

使用指導(dǎo)：

使用GsmartI Pfu DNA Polymerase的操作步驟建議：

打開前所有管子都需要輕輕混勻和離心以保證溶液的均一性和利用率，PCR反應(yīng)液應(yīng)放置于冰上配制。如果擴(kuò)增多個樣本，可以配制反應(yīng)mix，最后加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

1. 反應(yīng)體系：

?推薦的引物終濃度為0.2uM，但可以根據(jù)需要在0.1-0.5uM范圍內(nèi)變化。

?2. 將反應(yīng)管上下顛倒混勻數(shù)次，盡量避免產(chǎn)生氣泡，最后使用微型離心機(jī)離心

3. PCR反應(yīng)程序：

備注：

? ? ?? 建議以引物的Tm-5℃作為退火溫度；

? ? ?? 延伸速度以1-2kb/min計算

?

反應(yīng)混合物的組分：

• 酶：酶的最佳用量取決于模板量和PCR產(chǎn)物的長度。一般50ul反應(yīng)體系中用2.5U的GsmartI Pfu DNA Polymerase就能得到較好的結(jié)果；對于某些PCR，可以適當(dāng)增加酶的用量，但是不要超過5U/50ul體系建議最后一步加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

• Buffers：提供10x Pfu Buffer

• dNTP：GsmartI Pfu DNA Polymerase擴(kuò)增需要高質(zhì)量的dNTP ，4種dNTP中每種最佳濃度為100uM. GsmartI Pfu DNA Polymerase不能識別dUTP、dITP或其衍生物，故不能使用包含dUTP、dITP及其類似物的模板和引物。

• 模板：50ul 反應(yīng)體系中，低復(fù)雜度的模板DNA（比如質(zhì)粒、λDNA和BAC DNA等）用量1pg-100ng；高復(fù)雜度的基因組DNA模板用量為50-250ng，如果cDNA合成反應(yīng)混合液，模板體積不要超過PCR總反應(yīng)體積的1/10.

• DMSO（可選）：對于高GC模板，推薦的DMSO終濃度為3%；DMSO也可以用于超螺旋質(zhì)粒的解旋和變性。如果反應(yīng)體系中添加高濃度的DMSO，要降低退火溫度，因為DMSO會影響引物的熔點。據(jù)報道10%DMSO可以使退火溫度降低5.5-6.0℃.

反應(yīng)條件建議：

• 起始變性溫度：變性溫度為95℃，由于GsmartI Pfu DNA Polymerase具有較高的熱穩(wěn)定性，可以使用更高的變性溫度。95℃起始變性溫度下變性時間推薦使用4min，有些模板推薦使用更長的變性時間，變性時間可以延伸至5min.

• 變性溫度：對大多數(shù)模板來說，94℃下變性30s已經(jīng)足夠

• 引物退火：引物Tm－5℃退火10-30s；

• 延伸：延伸在72℃下進(jìn)行，延伸時間依賴于擴(kuò)增子的程度和復(fù)雜度，對于低復(fù)雜度的基因組DNA，延伸速度為15-30s/kb；對于高難度的基因組DNA延伸速度為30-60s/kb；對于cDNA模板，若想獲得比較理想的結(jié)果，延伸速度為30-60s/kb.

引物設(shè)計建議：

• 引物長度一般為16-30bp
• 引物3’端最后一個堿基最好是G或C
• 引物3’端最后幾個堿基避免出現(xiàn)連續(xù)錯配
• 引物3’端避免有發(fā)夾結(jié)構(gòu)或堿基修飾，
• 如擴(kuò)增編碼區(qū)，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，以免影響擴(kuò)增特異性和效率
• 正向引物和反引物的Tm值不要相差太大，Tm值盡量控制在55-65℃
• 引物的GC含量盡量控制在40%-60%之間
• 引物A、T、C、G應(yīng)均勻分布，避免使用GC或TA含量高的區(qū)域

可能會遇到的問題及解決辦法：

1. 無擴(kuò)增產(chǎn)物或擴(kuò)增效率低

2. 出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增或smear帶：

Gsmartl Pfu DNA Polymerase.pdf