濃度：5U/ul

貨號：GWP100

有效期：24個月

保存條件：-20℃

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產品簡介：

GsmartI pfu DNA Polymerase適用于對PCR產物保真性要求高的實驗，即便使用困難模板該酶也能精確快速的進行PCR擴增。GsmartI pfu DNA Polymerase的高保真性使其成為克隆的最佳選擇。該酶具有5-3聚合酶活性和3-5外切酶活性，3-5外切酶活性可以在聚合反應中糾正錯誤參入的堿基，使其具有較高的保真性，該酶不僅適合擴增端片段序列也適合擴增長片段序列，該酶PCR擴增產物為平末端，可以直接進行平末端克隆。

主要應用：

• 高保真PCR擴增
• 擴增DN**段用于基因表達克隆
• 擴增DN**段可用于平末端連接
• 基因定點突變

?擴增能力：

• 延伸速度為2kb/min
• 簡單模板，如以λDNA為模板，可以有效擴增不超過12kb片段（≤12kb）
• 復雜模板，如以人基因組為模板，可以游俠擴增不超過3kb片段（≤3kb）

活性單位定義：

用活化的大馬哈魚精子DNA做模板，74℃ 30min內攝入10nmol全核苷酸為酸性不溶物的活性定義為一個活性單位，即1U。

注意事項：

• 推薦退火溫度為引物Tm值－5℃；
• 延伸速度1-2kb/min；
• 50ul體系中GsmartI Pfu DNA Polymerase的用量為2.5 U；
• 使用dNTP，dUTP將導致PCR失??；
• GsmartI Pfu DNA Polymerase產生平末端DNA產物；

使用指導：

使用GsmartI Pfu DNA Polymerase的操作步驟建議：

打開前所有管子都需要輕輕混勻和離心以保證溶液的均一性和利用率，PCR反應液應放置于冰上配制。如果擴增多個樣本，可以配制反應mix，最后加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

1. 反應體系：

?推薦的引物終濃度為0.2uM，但可以根據需要在0.1-0.5uM范圍內變化。

?2. 將反應管上下顛倒混勻數次，盡量避免產生氣泡，最后使用微型離心機離心

3. PCR反應程序：

備注：

? ? ?? 建議以引物的Tm-5℃作為退火溫度；

? ? ?? 延伸速度以1-2kb/min計算

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反應混合物的組分：

• 酶：酶的最佳用量取決于模板量和PCR產物的長度。一般50ul反應體系中用2.5U的GsmartI Pfu DNA Polymerase就能得到較好的結果；對于某些PCR，可以適當增加酶的用量，但是不要超過5U/50ul體系建議最后一步加入GsmartI Pfu DNA Polymerase。

• Buffers：提供10x Pfu Buffer

• dNTP：GsmartI Pfu DNA Polymerase擴增需要高質量的dNTP ，4種dNTP中每種最佳濃度為100uM. GsmartI Pfu DNA Polymerase不能識別dUTP、dITP或其衍生物，故不能使用包含dUTP、dITP及其類似物的模板和引物。

• 模板：50ul 反應體系中，低復雜度的模板DNA（比如質粒、λDNA和BAC DNA等）用量1pg-100ng；高復雜度的基因組DNA模板用量為50-250ng，如果cDNA合成反應混合液，模板體積不要超過PCR總反應體積的1/10.

• DMSO（可選）：對于高GC模板，推薦的DMSO終濃度為3%；DMSO也可以用于超螺旋質粒的解旋和變性。如果反應體系中添加高濃度的DMSO，要降低退火溫度，因為DMSO會影響引物的熔點。據報道10%DMSO可以使退火溫度降低5.5-6.0℃.

反應條件建議：

• 起始變性溫度：變性溫度為95℃，由于GsmartI Pfu DNA Polymerase具有較高的熱穩定性，可以使用更高的變性溫度。95℃起始變性溫度下變性時間推薦使用4min，有些模板推薦使用更長的變性時間，變性時間可以延伸至5min.

• 變性溫度：對大多數模板來說，94℃下變性30s已經足夠

• 引物退火：引物Tm－5℃退火10-30s；

• 延伸：延伸在72℃下進行，延伸時間依賴于擴增子的程度和復雜度，對于低復雜度的基因組DNA，延伸速度為15-30s/kb；對于高難度的基因組DNA延伸速度為30-60s/kb；對于cDNA模板，若想獲得比較理想的結果，延伸速度為30-60s/kb.

引物設計建議：

• 引物長度一般為16-30bp
• 引物3’端最后一個堿基最好是G或C
• 引物3’端最后幾個堿基避免出現連續錯配
• 引物3’端避免有發夾結構或堿基修飾，
• 如擴增編碼區，引物3’端不要終止于密碼子的第3位，以免影響擴增特異性和效率
• 正向引物和反引物的Tm值不要相差太大，Tm值盡量控制在55-65℃
• 引物的GC含量盡量控制在40%-60%之間
• 引物A、T、C、G應均勻分布，避免使用GC或TA含量高的區域

可能會遇到的問題及解決辦法：

1. 無擴增產物或擴增效率低

2. 出現非特異性擴增或smear帶：

Gsmartl Pfu DNA Polymerase.pdf