產(chǎn)品說(shuō)明
唾液酸一類(lèi)九碳酸性單糖的N-或O-衍生物總稱(chēng)。這些糖中最常見(jiàn)的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)。?唾液酸廣泛分布在哺乳動(dòng)物組織和體液(如血清)中。唾液酸寡糖已被證實(shí)具有抗病毒特性，還會(huì)影響血液凝固和膽固醇水平。?體液中唾液酸的含量也是診斷癌癥的重要指標(biāo)。簡(jiǎn)單、直接和自動(dòng)化測(cè)量唾液酸濃度的方法應(yīng)用廣泛。BioAssay?Systems用一種酶反應(yīng)的工作試劑檢測(cè)樣品中唾液酸的含量。反應(yīng)產(chǎn)物在570nm的光密度或熒光強(qiáng)度(585/530nm)與樣品中唾液酸的濃度成正比。
產(chǎn)品特點(diǎn)
靈敏、準(zhǔn)確：僅用10μL樣品，檢測(cè)范圍：比色法0.02-1?mM，熒光法2-100?μM唾液酸。
簡(jiǎn)單、方便：使用一種工作試劑，室溫下反應(yīng)60分鐘可測(cè)游離唾液酸；或通過(guò)水解處理得到總唾液酸含量。
產(chǎn)品用途
直接檢測(cè)：生物樣品中唾液酸含量。
試劑盒組成
緩沖液：?10?mL | 顯色劑?：120?mL | 酶試劑：120?mL |
標(biāo)準(zhǔn)品：500?mL10?mM | 水解試劑：10?mL??????? | 中和試劑：5?mL |
儲(chǔ)藏條件：該試劑盒用冰袋運(yùn)輸。所有組份在-20°C下保存。保質(zhì)期3個(gè)月。
預(yù)防措施：本產(chǎn)品僅供研究用。使用過(guò)程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)安全措施。
唾液酸水解步驟
注意：測(cè)量游離唾液酸不需此步驟。
1、將20?mL樣本和80?mL水解液混合加入離心管中。在80°C下反應(yīng)60分鐘。
2、讓樣品冷卻到室溫并在14000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心1分鐘。
3、在每個(gè)水解反應(yīng)管中加20?mL中和試劑,?混勻，在14000轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下離心幾秒。樣品可用于總唾液酸的檢測(cè)。
比色法測(cè)試
注意：含有巰基的試劑(如：巰基乙醇、二硫蘇糖醇)會(huì)干擾反應(yīng)，在樣品準(zhǔn)備過(guò)程中避免使用。
1、將所有組分放置至室溫。酶試劑置冰上或冰箱中。?混合50mL?10mM的標(biāo)準(zhǔn)品和450mL蒸餾水得到1mM標(biāo)準(zhǔn)液。按照下表加入蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)液。
No | Premix?+?H2O | Vol?(mL) | Sialic?Acid?(mM) |
1 | 100mL?+???0mL | 100 | 1.0 |
2 | ?60mL?+??40mL | 100 | 0.6 |
3 | ?30mL?+??70mL | 100 | 0.3 |
4 | ??0mL?+?100mL | 100 | ?0 |
轉(zhuǎn)移10?μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液和10?μL樣品到平底透明的96孔板的不同孔中。
2、?配制足夠的工作試劑。對(duì)于每個(gè)反應(yīng)孔，混合93μL緩沖液,?1μL顯色劑和1μL酶試劑。在每個(gè)孔內(nèi)加入90μL工作試劑。輕擊平板混勻。
、室溫下反應(yīng)60分鐘。在570nm?(550-585nm)讀吸光值。注意：若樣品的OD值高于1mM標(biāo)準(zhǔn)液的OD值，用水稀釋樣品重新測(cè)試，將得到的結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)n。
濃度計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品吸光值減去空白對(duì)照的吸光值?(#4)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率(Slope)，計(jì)算樣品唾液酸的濃度。
ODSAMPLE和ODH2O是樣品和水的吸光值，n是稀釋倍數(shù)(水解樣品n?=?6)。
單位換算：1?mM?NANA?=?30.9?mg/dL?或?309?ppm。
熒光法測(cè)試
1、熒光法的線(xiàn)性范圍是2-100?μM唾液酸。將比色法的標(biāo)準(zhǔn)液以1:10的比例稀釋。?轉(zhuǎn)移10?μL稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)液和10?μL樣品到黑色96孔板的不同孔中。
2、在每個(gè)孔內(nèi)加入90μL工作試劑(見(jiàn)比色法的步驟)，輕敲平板混勻試劑。
3、在常溫下反應(yīng)60分鐘并在λex?=?530nm和λem?=?585?nm處讀熒光強(qiáng)度。
如果在384孔板測(cè)試，用5μL標(biāo)準(zhǔn)液和45μL工作試劑。
計(jì)算樣品唾液酸的濃度：
FSAMPLE和FH2O是樣品和水的熒光強(qiáng)度，n是稀釋倍數(shù)。
實(shí)驗(yàn)必需品(未提供)
移液裝置，離心管，透明平底96孔板，光密度閱讀儀，黑色平底96孔板或384孔板，熒光板閱讀儀。
參考文獻(xiàn)
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