概念

細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是機體為維持內穩態、正常發育，清除冗余，損壞或感染的細胞的一種主動生理過程，也是一種防御機制。

特征

細胞凋亡發生時會有形態和生化改變的顯著特征。形態變化主要體現在細胞皺縮，體積變小，細胞質膜起泡，到凋亡晚期時出現凋亡小體。凋亡小體包裹著細胞器和細胞核碎片，它們被巨噬細胞、薄壁細胞所吞噬，被吞噬溶酶體所降解，因而避免炎癥反應的發生。生化改變的典型特征是染色體的固縮和DNA片段化。核小體間連接區的雙鏈DNA片段化后其大小均為寡核小體DNA長度(180-200bp)的整倍數，因而在瓊脂糖凝膠電脈中呈現規則的“梯子”形(DNA ladder)?！?/span>DNA ladder”的出現可作為判別細胞凋亡的特異性指標，但若未檢出“DNA ladder”，亦不能排除凋亡的可能。

凋亡途徑

細胞凋亡可以在不同的刺激下誘導發生，在哺乳動物中，細胞凋亡信號通路主要分為4類：

l 線粒體通路：主要由多種壓力信號，例如，DNA化學損傷，UV輻射，生長因子缺乏等引起，也稱內源細胞凋亡通路；

l 死亡受體途徑：由細胞表面的受體信號所介導，也稱外源細胞凋亡通路；

l T細胞參與的細胞死亡途徑：此通路中，顆粒酶A或顆粒酶B均可誘導凋亡；

l 內質網通路：當內質網的蛋白折疊功能受到影響時，未折疊蛋白反應（UPR）將會被激活，繼而引發凋亡。

這四條信號通路既相互獨立又互相交叉，其核心的執行者都是一類蛋白：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）。

細胞凋亡檢測方法

1. 檢測Caspase切割法

Caspase是一類與凋亡密切相關的蛋白水解酶家族，一般在細胞中以酶原形式存在，只有在凋亡情況下，才會發生蛋白切割而激活。所以通過檢測Caspase的切割條帶，來表針凋亡的發生。小編前面也講到凋亡發生時，DNA會片段化，需要DNA修復酶來對DNA進行修補。PARP(poly ADP-ribose polymerase)就是一種DNA修復酶，它也是Caspase的切割底物，當它被切割時，同樣能說明凋亡的發生。

2. 檢測Bcl-2家族蛋白表達

線粒體凋亡途徑可以通過Bcl-2家族蛋白來調節和控制。Bcl-2家族蛋白控制線粒體膜的通透性從而影響細胞色素c的釋放，它們有的是促凋亡的，有的是抑制凋亡的，若促凋亡蛋白（Bax、Bad）表達量上升，同時抗凋亡蛋白（Bcl-2）Bcl-2表達量下降，也能說明凋亡發生。由于Bcl-2家族蛋白還參與其他通路，如細胞自噬通路。一般Bcl-2家族蛋白表達情況與凋亡其他檢測指標同時使用，增加說服力。

3. 檢測p53蛋白表達

p53是一種抑癌基因，其生物學功能是在G期監視DNA的完整性。如有損傷，則抑制細胞增殖，直到DNA修復完成。如果DNA不能被修復，則誘導其凋亡。在依賴p53蛋白的細胞凋亡中，p53蛋白能特異性地抑制Bcl-2的表達，但對Bax的表達有明顯的促進作用，在這些細胞中，p53的積累和活動引發了細胞凋亡。

4. 檢測細胞色素c的釋放

細胞色素c參與線粒體通路。隨著凋亡的進行，細胞色素c會從線粒體中釋放到細胞質中，所以檢測時，細胞質中的細胞色素c會增加，線粒體中的細胞色素c會減少。

5. Annexin V和PI雙染法檢測細胞凋亡

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力。因此Annexin V被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。Annexin V進行熒光素FITC標記后，可作為熒光探針，利用流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但對凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時期的細胞區分開來。

6. TUNEL法檢測細胞凋亡

細胞凋亡中，染色體 DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性 3'-OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA 的 3'-OH末端，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。TUNEL 實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，常用于組織的細胞凋亡檢測。

通常情況下，需要聯合使用多種檢測手段增加說服力，如通過WB檢測Caspase的自切割，對PARP的切割，Bcl家族蛋白的變化，通過流式檢測細胞水平上的凋亡情況，通過TUNEL檢測動物水平上的凋亡情況。