?

?

單克隆穩定細胞株構建實例（TALEN技術）

摘要：本實驗使用識別并切割AAVS1位點的TALENs質粒與帶有同源臂的模板質粒共轉，利用同源重組修復機制將模板質粒同源臂中間的表達框（CMV-EGFP-IRES-Puro-poly A）定點整合到293T細胞的19號染色體的AAVS1位點。再通過單克隆挑選技術獲得同時穩定表達EGFP和Puromycin抗性基因的細胞株。該穩定細胞株可以通過cre/loxp技術高效地整合其它外源基因。
關鍵詞：AAVS1，單克隆定點整合穩定細胞株， 293T，TALENs

?

一、?實驗原理
傳統的穩定株篩選方法需要通過外源基因的瞬時轉染后對靶細胞進行篩選， 最終獲得從單一細胞擴增起來的穩定細胞株， 該方法陽性率低，周期長，工作量大。同時，獲得穩定株中外源基因整合的位置不確定，對于后續的研究容易造成干擾。利用慢病毒必須整合到宿主基因組的特性來篩選穩定株的方法克服了雖然傳統方法的弊端，可以在短時間內獲得高效率的穩定細胞株。但是獲得的混合穩定株同樣整合位點隨機。而利用TALEN技術的定點整合技術可以將外源基因定點整合到公認的安全位點AAVS1，可以為基因功能的研究打下良好的基礎。

?

二、?實驗目的
通過TALEN技術結合單克隆挑選獲得同時穩定表達EGFP和Puromycin抗性基因的293T細胞株。

?

三、?實驗步驟
1.?細胞鋪板：
將293T細胞按70%的融合度接種到6孔板。
2.?質粒轉染：
16h后按照轉染試劑說明書轉染細胞（4μg混合質粒pTALEN-AAVS1-F，pTALEN-AAVS1-R，定點整合模板質粒（1:1:1），10μl和元生物轉染試劑）。
3.?穩定株篩選：
1)?72h以后，加入終濃度2μg/ml puromycin。每隔2-3天換一次終濃度2μg/ml puromycin的新鮮培養基。
2)?3-4天后，消化為單細胞，有限稀釋法將細胞鋪于96孔板。
3)?挑選有熒光的細胞單克隆繼續擴增后凍存。
4)?提取基因組DNA，PCR產物測序。

?

四、?實驗結果

?

?????????????????????????

??????????????????????????????????????????????????????????圖1. 測序結果比對圖

?結果：從圖1的測序結果比對可以看到，CMV-EGFP-IRES-Puro-polyA表達框已經成功整合到AAVS1位點。

五、?參考文獻
1.?Holkers M, Maggio I, Liu J, et al.,Differential integrity of TALE nuclease genes following adenoviral and lentiviral vector gene transfer into human cells.Nucleic Acids Res. 2013 ;5:e63.

?