一、免疫組化染色實驗原理及步驟 實驗原理 抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物后獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由于抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須借助于組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究。 免疫組化染色實驗步驟 1.石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自來水洗； 2.抗原修復：組織切片置于盛滿檸檬酸（PH6.0)抗原修復液的高壓鍋內進行抗原修復，噴氣計時2.5min， 自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min； 3.阻斷內源性過氧化物酶：切片放入0.3%甲醇過氧化氫溶液，室溫避光孵育 20 min，將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min； 4.BSA 或者血清封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止抗體流走），在圈內滴加用 5%BSA，室溫封閉 1h； 5.加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內 4°C 孵育過夜（濕盒內加少量水防止抗體蒸發）； 6. 加生物素二抗：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈內滴加生物素偶聯的二抗，覆蓋組織，室溫孵育 50min； 7.加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶：之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min；切片稍甩干后在圈內滴加鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶，覆蓋組織，室溫孵育 50min；之后玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 8min； 8. DAB 顯色：玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min；切片稍甩干后在圈內滴加新鮮配制的 DAB 顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色， 自來水沖洗切片終止顯色； 9. 復染細胞核：Harris 蘇木素復染 3min 左右，自來水洗，分化液分化數秒，自來水沖洗，流水返藍； 10. 脫水封片：將切片依次放入 75%酒精 6min-85%酒精 6min --無水乙醇Ⅰ6min -無水乙醇Ⅱ6min -二甲苯Ⅰ7min -二甲苯Ⅱ7min中脫水透明，將切片從二甲苯拿出來稍晾干，中性樹膠封片； 11. 顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。 二、染色結果判讀：蘇木素染細胞核為藍色，DAB 顯出的陽性表達為棕黃色。