?

人Oct-4過表達載體構建

摘要：和元生物以cDNA為模板，擴增Oct-4基因并構建入慢病毒載體pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。該載體骨架中EGFP-3FLAG與目的基因融合表達以利于后續的表達觀測和Western Blot研究，而puromycin抗性基因則利于穩定細胞株的篩選。該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成慢病毒用于穩定株的篩選以及在動物水平過表達Oct-4基因。

關鍵詞：Oct-4，過表達, EGFP-3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、?實驗原理
和元PCR擴增Oct-4基因序列，構建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro載體CMV-EGFP序列間的EcoR I多克隆位點，目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表達。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro載體圖譜如下：

?

二、?實驗目的
和元構建既可用于瞬時轉染又可用于穩定株篩選的Oct-4基因過表達慢病毒載體.

三、?實驗方法
和元PCR擴增的Oct-4基因序列與經由EcoR I酶切后的表達載體pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重組后轉化E.coli? DH5α感受態細胞。菌落PCR篩選到的陽性克隆送測序。經驗證無誤的進行質粒抽提。實驗步驟如下：
1.?引物設計：
和元從GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用VectorNTI軟件進行引物設計。PCR擴增目的基因：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴增目的基因，反應體系和條件如下：
?

?
2.?瓊脂糖凝電泳檢測PCR擴增結果：
和元目的基因PCR擴增成功后，進行瓊脂糖凝電泳檢測①，通過和DNA Maker的對比，判斷目的基因是否擴增成功。
3.?膠回收目的基因片段：
和元把目的基因條帶從瓊脂糖凝電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟步驟參考試劑盒說明書。
4.?線性化表達載體的制備：
和元用限制性內切酶對表達載體的進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10 x反應Buffer 5μL，限制性內切酶各1μL，用水補足50μL，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的基因同源重組到線性化表達載體中：


6.?感受態細胞的制備和轉化：
和元DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》②
7.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
和元挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

?

8.?陽性克隆送測序：
和元菌落鑒定得到的陽性克隆，送公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
9.?質粒小提：
和元測序通過的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、和元實驗結果
1.?PCR擴增目的基因：
和元用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT（含同源重組序列、EcoR I酶切位點、Kozak序列，并含有目的基因5’端配對序列用于PCR擴增目的基因），反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC（引物說明：含同源重組序列、EcoR I酶切位點，并含有目的基因3’端配對序列用于PCR擴增目的基因）對人cDNA進行擴增，預期PCR產物大小為1126 bp，電泳結果如下：

DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2.?表達載體的線性化
和元用EcoR I對表達載體進行雙酶切，膠回收4801bp的載體片段，酶切圖譜如下：

?

??????????????????????????????????????????????????????????????
1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、?1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3.?菌落PCR鑒定陽性克隆
和元用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物CMV-F?? CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV啟動子序列中，反向引物pEGFP-N-3?? CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列，陽性克隆得到1287bp的片段，空載體對照得到252bp的片斷。電泳結果如下：
???????????????????????????????????????????????????????????? ?

1. 陰性對照（H2O）
2. 陰性對照（空載體）
3. DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp ?4~11?? 挑取的8個轉化子接種陽性克隆，保種并分裝100μL送測序。經驗證序列無誤的，抽提質粒。
4. 和元測序結果分析
陽性克隆測序結果表明，和預期序列完全一致。

?

五、和元參考文獻

1.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社，P57~58

2.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社，P25~26