【基因編輯】服務之一：CRISPR/Cas9基因敲除

簡介
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系統是目前被廣泛運用的基因編輯系統，其原理是由CRISPR轉錄產生的gRNA介導Cas核酸酶靶向目標序列，對序列進行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系統，此系統是由II類CRISPR/Cas系統改造而來，能夠在植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物等多種細胞中，進行有效的靶向編輯，具有操作簡易、效率高、以及作用靶位點多等優勢。
CRISPR/Cas9系統中sgRNA(small guide RNA)識別并結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），機體自身通過非同源重組（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修復DSB，參與修復的蛋白經常會在DNA末端插入或刪除幾個堿基，修復后的基因由于產生突變而導致功能喪失，從而實現機體內的基因敲除（Gene Knockout）。
其中Cas9可根據不同菌屬來源及大小進行分類，目前得到廣泛應用的有SpCas9和SaCas9，SpCas9來源于化膿性鏈球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶，由1368個氨基酸組成，可識別的PAM序列為NGG ，由于構建載體載量過大，因此所選擇的病毒載體有限，通常構建在慢病毒載體上；SaCas9是來源于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9核酸酶，由1053個氨基酸組成，可識別的PAM序列為NNGRRT，比SpCas9小25%，能夠進行AAV病毒的包裝，適用范圍更廣。

CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
????
非同源重組修復DSB（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）

應用
CRISPR/Cas9基因敲除細胞系建立
CRISPR/Cas9基因敲除建立動物疾病模型

技術優勢

1. 操作簡易：僅需Cas9核酸酶和sgRNA即可對目標基因靶位點進行切割；
2. 效率高：在基因組水平上編輯目標基因，高度模擬目標模型，可精確編輯基因組；
3. 作用靶位點多：可實現多個靶基因位點及多個基因的同時敲除；
4. 提供多種基因編輯病毒工具：AAV、LV；
5. 提供 BSL-1 和 BSL-2 病毒注射及實驗操作平臺；
6. 全面的實驗技術支持。

1. sgRNA的設計；
2. 細胞內sgRNA剪切活性篩選；
3. 敲除載體的構建；
4. 依據所要編輯的細胞選擇Cas9和sgRNA不同導入方式：

5. 篩選基因敲除單克隆細胞系。

????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

1. Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
2. Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.