實驗前請仔細閱讀產品說明書

聲明：尊敬的客戶，感謝您選用本公司的產品。本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!本試劑盒不含任何具有生物危害成分，但是試劑盒使用涉及的檢測樣本請在具有相應生物安全防護等級實驗室進行，由此可能造成的所有生物安全危害由使用者自行負責。

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試劑盒使用范圍：

本產品適用于體外定量檢測人血清、血漿，細胞培養液或其它相關生物液體中人呼吸道合胞病毒（RSV）F蛋白含量。

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?試劑盒組成：

使用前請仔細閱讀說明書并按下表檢查試劑盒組分！如有疑問，請立即聯系我們027-87877773。

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特別說明：

1.打開包裝后請及時檢查所有組分是否齊全完整；

2.一周內使用可暫存于4℃，如需遠期或多次頻繁使用，每次用完請按各組分建議的保存條件妥善存放。

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試劑盒介紹：

呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）屬于副黏病毒科的肺病毒屬（Pneumovirus），主要引起6個月以下嬰兒患細支氣管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及較大兒童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。其發生機制除病毒感染直接作用外，可能與嬰幼兒呼吸道組織學特性、免疫功能發育未完善及免疫病理損傷有關。嚴重RSV疾病免疫病理損傷主要是機體產生特異性IgE抗體與RSV相互作用引起Ⅰ型超敏反應。

本試劑盒適用于體外定量檢測人血清、血漿，細胞培養液或其它相關生物液體中呼吸道合胞病毒F蛋白含量。

試劑盒基本原理：

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯免疫定量法檢測human RSV-F蛋白含量，酶標板采用納米共價包被Human RSV F蛋白捕捉抗體，檢測時酶標板孔加入待檢樣品或標準品，再加入F蛋白檢測抗體（生物素化抗RSV F蛋白抗體）,反應后加入鏈霉親和素HRP，最后加入單組份TMB底物液顯色;如果待檢樣品中含有RSV-F蛋白，TMB底物液在HRP催化下顯色，加入終止液終止顯色后，在酶標儀OD₄₅₀/OD₆₃₀讀取吸光值，在合適濃度范圍內，吸光值大小與待檢測樣品中RSV-F蛋白濃度呈正相關，根據標準品濃度/吸光值繪制的標準曲線，可計算出待檢樣品中F蛋白含量。

實驗所需自備物品:

1.酶標儀(帶有450nm和630nm波長濾光片)

2.高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL

3.37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水

4.吸水紙

待檢測樣品的收集方法: ?

1.血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。

2.血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na₂，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。

3.組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，取上清檢測。

4.細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。

5.其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測。

6.樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。

7.樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。

8.如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先做預實驗，以確定稀釋倍數）。

檢測前準備工作:

1.請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，將各組分平衡至室溫。

2.洗滌液配制：將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結晶，屬于正?，F象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超過50℃，使用時洗滌液應為室溫），當日現配現用 。

3.標準品配制:瓶身標注有標準品含量 ：標準品為凍干品，使用前用PBS或者去離子水復溶到0.5ml（此時標準品濃度為C₀）,然后根據需要,取適量標準品用通用稀釋液 進行1：2倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃度：C₀、C₀/2、C₀/4、C₀/8、C₀/16、C₀/32、C₀/64，樣品稀釋液直接作為空白孔0。

例如：標準品管標注為25ng,加水0.5ml復溶，此時C₀=50ng/ml, 用通用稀釋液 進行1：2倍比稀釋最為標準品的濃度依次為50ng/ml,25 ng/ml，12.5 ng/ml，6.25 ng/ml，3.13 ng/ml，1.56 ng/ml，0.78 ng/ml，0 ng/ml（稀釋液作為空白對照）

4. 檢測抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），檢測抗體（100×）用通用稀釋液稀釋100倍，實際配制時應多配制100-200μL；

5.鏈霉親和素HRP工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），鏈霉親和素HRP（100×）用通用稀釋液稀釋100倍 ，實際配制時應多配制100-200μL；

6.TMB底物液:使用前，提前放置室溫平衡。

酶標板洗滌方法說明: ?

1.自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。

2.手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。

?試劑盒使用操作步驟:

實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時均需充分混勻，并盡量避免起泡。

1.? 加樣：分別設空白孔、標準品孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μL，標準品孔分別加入依次梯度稀釋的標準品，每孔100μL，待測樣品孔加待測樣品100μL，加完后，酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。

注意：為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新的標準品溶液。

2.? 加檢測抗體：棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干。立即每孔加入配好的檢測抗體工作液100μL（在使用前15 分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。加完后酶標板覆膜，37℃孵育60分鐘。

注意：為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新鮮配置的檢測抗體工作液。

3.? 加鏈霉親和素HRP：棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；立即每孔加入配好的鏈霉親和素HRP工作液100μL（在使用前15分鐘內配制），注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育45分鐘。

注意：為保證實驗結果有效性，每次實驗請使用新鮮配置的鏈霉親和素HRP工作液。

4.? 加TMB底物顯色：棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘， 350μL/每孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內液體拍干；每孔加TMB底物溶液100μL，酶標板加覆膜，室溫避光顯色15分鐘左右（根據實際顯**況酌情縮短或延長，但不超過30分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。

5.? 終止顯色：每孔加終止液90μL，此時藍色立轉為黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入時序相同。?

6.? 酶標儀讀數：終止顯色后立即用酶標儀在 450nm 波長（630nm作為參考波長）讀取各孔的光密度（OD值）。

注意：應提前打開酶標儀電源，預熱儀器，提前設置好檢測程序。

7.? 實驗試劑歸位：實驗完畢后，將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。

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標準曲線繪制及結果計算:

1.? 以標準品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線。如有設置復孔，則應取其平均值計算。

2.? 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。

3.? 若樣品OD值高于或者接近標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數; 若樣品OD值低于或者接近標準曲線下限，應適當濃縮樣品后重測，計算濃度時應除以稀釋倍數：。

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注意事項：

1.? 試劑盒保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染，否則可能會造成試劑盒性能下降或者失效。

2.? 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！

3.? 加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在10分鐘內。推薦設置復孔。

4.? 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標板處于干燥狀態；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。

5.? 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。

6.? 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很明顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數。

7.? 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

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