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細胞免疫熒光實驗

摘要：在293T細胞中過表達human pescadillo（PES1）基因，利用免疫熒光技術研究PES1在細胞中的表達和定位。實驗結果表明PES1定位于細胞核的核仁。該實驗結果為進一步深入研究PES1基因的功能提供實驗數據。
關鍵詞：PES1，免疫熒光， 蛋白定位，293T

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一、?實驗原理
免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)。在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。

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二、?實驗目的
使用過表達PES1-3FLAG的慢病毒感染293T細胞，利用Anti-FLAG抗體進行免疫熒光，觀察PES1蛋白的表達以及在細胞中的定位。

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三、?實驗步驟
1.?細胞鋪板：
細胞鋪板：將細胞按20-30%的匯合度接種到24孔細胞培養板中的圓形蓋玻片上。
2.?病毒感染：
病毒感染：細胞貼壁后使用PES1過表達慢病毒感染細胞，MOI =10。
3.?免疫細胞化學染色：
1)?固定：病毒感染72h后，吸去細胞培養液，每孔用500μl DPBS洗細胞2次，之后每孔加250μl 4% 多聚甲醛，室溫固定15-20min。
2)?封閉：封閉液配制如下：
????????????????? 94%??? 0.1M TBS
????????????????? 3%???? Normal Goat Serum
????????????????? 3%???? 10% Triton X-100
去除TBS，24孔板每個孔加入500μl封閉液，室溫孵育1h封閉。
3)?染一抗：吸出封閉液，每個孔再加入500μl封閉液，根據1:1000加入一抗，4℃孵育過夜。
4)?染二抗：一抗染色結束后，移去含一抗的封閉液，用1ml TBS洗三次。吸出TBS，每個孔加入500μl封閉液孵育30min。按1:500加入二抗，室溫搖晃孵育60-120min。可在孵育60min后加入終濃度為100ng/ml的DAPI繼續孵育。由于二抗帶有熒光標記，熒光信號容易淬滅，加入二抗及之后的過程需注意避光。二抗孵育結束后，移去含二抗的封閉液，用1ml TBS洗三次，可直接在熒光顯微鏡下進行觀察或者進行封片保存。
5)?封片：在載玻片是滴一小滴mounting medium，小心地將cover slip從細胞培養板中取出，種植有細胞面朝下輕輕地蓋在mounting medium。4℃孵育過夜晾干。過程中要注意避免產生氣泡，mounting medium很粘稠，滴加的時候需小心。

4.?共聚焦熒光顯微鏡拍照：
封片后可在熒光顯微鏡下進行觀察，亦可置于4℃長期保存。

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四、?實驗結果

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??????????????????????????????????????????????????????????????????????圖1. 低倍鏡觀察PES1蛋白在293T細胞中的定位

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???????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖2. 高倍鏡觀察PES1蛋白在293T細胞中的定位

?從實驗結果可以看到PES1蛋白定位在細胞的核仁位置。

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五、?參考文獻
1.?Griffiths G, Parton RG, Lucocq J, van Deurs B, Brown D, Slot JW, Geuze HJ. The immunofluorescent era of membrane traffic. Trends Cell Biol. 1993 Jul;3(7):214-9.
2.?Garini Y, Vermolen BJ, Young IT. From micro to nano: recent advances in high-resolution microscopy. Curr Opin Biotechnol. 2005 Feb;16(1):3-12.
3.?Tokuyasu KT. A study of positive staining of ultrathin frozen sections. J Ultrastruct Res. 1978 Jun;63(3):287-307.
4.?EM, Horstmann H, Almers W, Maniak M, Soldati T. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 1998;121(3):326-42.
5.?Neuhaus EM, Almers W, Soldati T. Morphology and dynamics of the endocytic pathway in Dictyostelium discoideum. Mol Biol Cell. 2002 Apr;13(4):1390-407.

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