Percoll 細胞分離液
產品名稱: Percoll 細胞分離液
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產品編號: 17-0891-01
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產品產地: Pharmacia
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| 說明:適合分離細胞,亞細胞成分和大病毒(>70S),滲透壓均勻,粘度低,可調至生理離子強度和pH,分離條件溫和,對細胞無毒性,可以滅菌消毒。 |
| 密度:1.13g/ml |
| 儲存條件:2-8℃???????????????????????????? |
Percoll 細胞分離液?圖片▼


Percoll不連續密度梯度沉淀法分離純化淋巴細胞和淋巴母細胞
(一) 原理
Percoll是一種包有乙烯吡咯烷酮的硅膠顆粒。滲透壓很低(<20mosm/kg H2O), 粘度也很小,可形成高達1.3g/ml密度,采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200~1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。由于Percoll擴散常數低,所形成的梯度十分穩定。此外,Percoll不穿透生物膜,對細胞無毒害,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒,還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。
(二)操作方法及注意事項
1.不同濃度(密度)Percoll溶液的制備: 先用9份Percoll與1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
Percoll濃度(%) 70 60 50 40 30 20
比重g/ml ? 1.090???? 1.077???? 1.067???? 1.056???? 1.043?????? 1.031
??? 2.不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤,除去多余血清,這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。
??? 3.裝樣:樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。
??? 4.離心:一般采用離心力為400g,時間20~25min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機加速、降速時要慢,要平穩。
??? 5.取樣:當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時,可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。
(三)分離純化細胞舉例
1.富含NK活性大顆粒淋巴細胞(LGL)的純化:按順序由下向上逐層加50%、47.5%、45%、42.5%和40%五種不同密度的Percoll,如用10ml試管(或塑料管)分離,每層Percoll約1.2~1.5ml,初步從外周血中分離的PBMC細胞1×108懸于1ml培基中,按要求裝樣、離心和取樣。一般富含NK殺傷活性的LGL細胞位于42.5%與45%Percoll界面以及上下二層的Percoll液中。
??? 2.純化淋巴母細胞和除去死細胞:分別疊加50%和30%Percoll液。收取經PHA(或其它抗原、有絲分裂原)刺激PBMC,或含有較高比例異型的PBMC(如腎綜合征出血熱患者),按要求裝樣、離心和取樣。位于管底的淋巴細胞為小淋巴細胞;兩層Percoll之間為淋巴母細胞,純度和回收率在80%以上,位于30%Percoll表面是死細胞。收獲淋巴母細胞可進行表型、結構以及功能的研究。
(四) 人不同血細胞的漂浮密度
表 人不同血細胞的漂浮密度
──────────────┬──────────────────
細 胞 漂浮密度 │ 細 胞 漂浮密度
──────────────┼──────────────────
紅細胞 1.09-1.11 │淋巴細胞 1.052-1.077
粒細胞 ? │ B淋巴細胞 1.062-1.075
嗜酸性 1.09-1.095 ? │ T淋巴細胞 1.065-1.077
嗜中性 1.080-1.085 │ 淋巴母細胞 1.065-1.077
單核細胞 1.050-1.066 │自然殺傷細胞 1.050-1.070
血小板 1.030-1.060 │
適合分離細胞,亞細胞成分和大病毒(>70S),滲透壓均勻,粘度低,可調至生理離子強度和pH,分離條件溫和,對細胞無毒性,可以滅菌消毒。
Percoll分離液是一種經過聚乙烯吡咯烷酮處理過的硅膠顆粒,經過高速離心后可形成連續密度梯度,由于Percoll擴散常數低,所形成的梯度十分穩定。Percoll分離液采用預先形成的密度梯度時可在低離心力(200~1000g)于數分至數十分鐘內達到滿意的細胞分離結果。此外,Percoll分離液不穿透生物膜,對細胞無毒害,因此廣泛用于分離細胞、亞細胞成分、細菌及病毒,還可將受損細胞及其碎片與完好的活細胞分離。Percoll常用于分離和傳話植物原生質體、核、葉綠體、和線粒體。
Percoll分離液的配置與使用
1、不同濃度(密度)Percoll分離液的制備: 先用9份Percoll分離液與1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合達到生理性滲透壓,然后用生理溶液(0.85% NaCl或0.15M PBS)稀釋到所需濃度。
2、不連續密度梯度Percoll層的制備: 先將試管壁用牛血清濕潤,除去多余血清,這種預處理可使逐層疊加的Percoll液平穩沿管壁流下,使形成滿意的界面。在制備過程中一般用長針頭注射器從高密度向低密度逐層放置,有時相鄰兩層Percoll比重相差不大時,可將Percoll液放入注射器中,小針頭斜面緊貼管壁,任其自然慢慢流下。
3、裝樣:樣品體積和細胞濃度根據不同細胞而異,一般加樣體積不宜過大,細胞濃度也不可過高,否則會影響細胞的分離和回收。
4、離心:一般采用離心力為400g,時間20~25min。由于多層Percoll之間密度差別不大,因此離心機加速、降速時要慢,要平穩。
5、取樣:當所要分離的細胞絕大部分在兩層的界面時,可逐層去除Percoll液后收集界面部位的細胞;有時大部分細胞位于Percoll層中,則需要逐層收集。收獲含有Percoll液的細胞經2次洗滌后可供培養或檢測用。
Percoll細胞分離液的優點
Percoll滲透性低、不穿透細胞、密度高、無毒害,是目前較理想的介質。Percoll密度梯度離心已被多次成功地用于動物細胞及其細胞器的分離,純化了包括人血液細胞、骨髓細胞、紅血球細胞、白血球細胞、淋巴細胞、肝細胞等在內的十余種動物細胞。
Percoll細胞分離液注意事項:
1、Percoll細胞分離液在儲存及孵育過程中避免將實際保留在強光中。
2、試劑瓶蓋需蓋緊,防止蒸發和污染。
?適合分離細胞、亞細胞成分和大病毒(>70s),滲透壓均勻,粘度低,可調至生理離子強度和pH,分離條件溫和,對細胞無毒性,可以滅菌消毒。密度為1.13g/ml。
?牛血清白蛋白[組份五]?Albumin from bovine serum[BSA]?Roche[分]?5g
牛血清白蛋白[組份五]?Albumin from bovine serum[BSA]?Roche[分]?5g*10
****?膽固醇?Cholesterol?國產?100g
****?膽固醇?Cholesterol?國產?100g*10
****?瓊脂糖?Agarose?西班牙?100g
****?瓊脂糖?Agarose?西班牙?100g*10
****?瓊脂糖?Agarose?西班牙?100g
****?瓊脂糖?Agarose?西班牙?100g*10
?G-418?G-418[Geneticin]?Invitrogen?100mg
?G-418?G-418[Geneticin]?Invitrogen?1g
?羧芐青霉素?Carbenicillin 2Na?Amresco[分]?100mg
?羧芐青霉素?Carbenicillin 2Na?Amresco[分]?100mg*10
?瓊脂粉?Agar?Japan[分]?500g
?瓊脂粉?Agar?Japan[分]?500g*10
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Sigma?100ml
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Sigma?500ml
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Sigma[分]?100ml
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Sigma[分]?100ml*10
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Amresco[分]?100ml
?二甲基亞砜?Dimethyl Sulfoxide[DMSO]?Amresco[分]?100ml*10
碘化丙碇?Propidium iodide[PI]?Sigma[分]?10mg
?碘化丙碇?Propidium iodide[PI]?Sigma[分]?100mg
D8220?二硫蘇糖醇?1,4-Dithiothreitol[DTT]?Merck?1kg
D8220二硫蘇糖醇?1,4-Dithiothreitol[DTT]?Merck?1kg*3
D8220?二硫蘇糖醇?1,4-Dithiothreitol[DTT]?Merck[分]?1g
D8220?二硫蘇糖醇?1,4-Dithiothreitol[DTT]?Merck[分]?5g
A8180?氨芐青霉素 [鈉]?Ampicillin Sodium Salt?Amresco[分]?1g
A8180?氨芐青霉素 [鈉]?Ampicillin Sodium Salt?Amresco[分]?5g
?甲酰胺?Formamide?Amresco[分]?100ml
?甲酰胺?Formamide?Amresco[分]?100ml*5
M8200 甲叉雙丙烯酰胺?N,N′-Methylenebisacrylamide?Amresco[分]?25g
M8200 甲叉雙丙烯酰胺?N,N′-Methylenebisacrylamide?Amresco[分]?25g*10
G8190?甘油?Glycerol?Amresco[分]?100ml
G8190?甘油?Glycerol?Amresco[分]?100ml*10
X80505-溴-4-氯-3-吲哚-beta-D-半乳糖苷?X-gal?Amresco[分]?100mg
X8050?5-溴-4-氯-3-吲哚-beta-D-半乳糖苷?X-gal?Amresco[分]?100mg*10
利福平?RifampicinSolarbio[分]?250mg
?利福平?Rifampicin?Solarbio[分]?1g
利福平?Rifampicin?sigma?250mg
?利福平?Rifampicin?sigma?1g
T8090 四甲基乙二胺?TEMED?Sigma[分]?100ml
潮霉素B?Hygromycin B?Roche?1g
姬姆色素染料?Giemsa stain?Amresco[分]?1g
?姬姆色素染料?Giemsa stain?Amresco[分]?1g*10
?無氨基酵母氮源 YNB [分]?100g
纖維蛋白原[分]?100mg
I8070 異丙基-β-D-硫代半乳糖苷?IPTG?Merk 1kg
I8070異丙基-β-D-硫代半乳糖苷?IPTG?Merk[分]?1g
I8070異丙基-β-D-硫代半乳糖苷?IPTG?Merk[分]?5g
?N8140氯化**四氮唑蘭?Nitrotetrazoliumbluechloride[NBT]?Amresco[分]?100mg
?I8040牛胰島素?Insulin?Sigma[分]?25mg
