產品介紹

為解決BCECF AM的異構體問題，研究人員開發了BCFL探針。與BCECF類似，BCFL同樣具有pH依賴的雙激發特性，其pKa值約為7.0。BCFL在454nm處具有等吸收點的雙激發光譜，使其成為優異的激發比率法pH指示劑。BCFL比率成像技術不受染料濃度、光程、細胞滲漏和光漂白率等變量的影響。BCFL AM為單一異構體，相比含多種異構體的BCECF AM，其pH測量結果具有更好的可重復性。

產品優勢

不受染料濃度、光程長度、細胞滲漏以及光漂白速率等多種變量因素的影響。

實驗方案

儲備液配制

（注意事項：若無特殊說明，所有未使用的儲備液均應分裝為單次使用量，配制完成后保存于-20°C，避免反復凍融。）

RatioWorks™ BCFL AM儲備液

使用高純度無水DMSO配制10-20 mM的RatioWorks™ BCFL AM儲備液。

注：溶解于DMSO后，RatioWorks™ BCFL AM應為無色透明溶液。

工作液配制

RatioWorks™ BCFL AM工作液

實驗當天，將RatioWorks™ BCFL AM溶解于DMSO或取適量儲備液恢復至室溫。使用選定緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）配制5-50 μM的工作液。

注意：1.使用非離子型表面活性劑Pluronic® F-127提高AM酯的水溶性，染色緩沖液中Pluronic® F-127終濃度建議為0.02%（百螢生物提供多種Pluronic® F-127產品）。

           2.若細胞存在有機陰離子轉運體，可在工作液中加入1-2 mM丙磺舒（孔內終濃度0.5-1 mM）以減少去酯化探針的滲漏（百螢生物提供多種ReadiUse™丙磺舒產品，包括水溶性鈉鹽和穩定溶液等）。

實驗操作流程

（以下為哺乳動物活細胞加載RatioWorks™ BCFL AM的推薦方案，請根據實際需求調整。）

1.按實驗要求制備活性細胞。

2.次日，向細胞板中加入RatioWorks™ BCFL AM工作液（96孔板：100 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

注意：若待測化合物與血清存在干擾，需在染料加載前用新鮮HHBS緩沖液替換生長培養基（96孔板：100 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

3.將加載染料的細胞板置于37°C培養箱中孵育30-60分鐘。

4.使用HHBS或選定緩沖液替換染料工作液，去除多余染料。

5.使用HHBS或選定緩沖液制備化合物板（96孔板：50 μL/孔；384孔板：25 μL/孔）。

6.進行pH檢測，并同步選用以下任一方式進行熒光監測：

配備FITC濾光片組的熒光顯微鏡 

熒光酶標儀（激發/發射波長=490/535 nm，截止波長515 nm）

比率法檢測需同步監測：

激發/發射1=430/535 nm（截止515 nm）

激發/發射2=505/535 nm（截止515 nm）