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細胞周期實驗

摘要： 使用Thymidine雙阻斷法對HeLa S3細胞進行同步化，再利用PI染色法對同步化效果進行評價。實驗結果顯示Thymindine雙阻斷法可以有效的將HeLa S3 細胞同步化在G1/S期，釋放后細胞可以高效地同步釋放。該實驗可以為進一步深入研究不同細胞周期中特定基因的功能提供實驗基礎。
關鍵詞：HeLa S3，Thymidine， 細胞同步化，PI染色法，FACS

一、?實驗原理
細胞周期（cell cycle）是指細胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結束所經歷的全過程，分為間期與分裂期兩個階段。細胞周期反應了細胞增殖速度。單個細胞的周期測定可采用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多采用其他方法測群體周期測定細胞周期的方法很多，最常用的是PI滲入測定細胞周期。PI，即碘化丙錠，可以與細胞內DNA 和RNA 結合，采用RNA酶將RNA消化后，通過流式細胞術檢測到的與DNA 結合的PI 的熒光強度直接反映了細胞內DNA含量的多少。由于細胞周期各時相的DNA 含量不同，通常正常細胞的 G0/G1 期具有二倍體細胞的DNA 含量(2N) ，而G2/ M 期具有四倍體細胞的DNA 含量(4N) ，而S 期的DNA含量介于二倍體和四倍體之間。因此，通過流式細胞術PI染色法對細胞內DNA 含量進行檢測時，可以將細胞周期各時相區分為 G0/G1 期，S 期和G2/ M 期，并可通過特殊軟件計算各時相的百分率。

二、?實驗目的
使用Thymidine雙阻斷法對HeLa S3細胞進行同步化，再利用PI染色法結合流式細胞術對同步化效果進行評價。

三、?實驗步驟
實驗共分以下4個主要步驟：
1.?細胞鋪盤：
HeLa S3細胞，密度為80%左右分盤， 使鋪盤密度在50%左右，為滿足流式細胞儀上機要求，細胞數目需大于1×106/組。
2.?細胞同步化處理：
1)?加入終濃度2mM的Thymidine同步化18h。
2)?用溫育的PBS洗4次， 更換新鮮培養基，培養9h。
3)?再加入2mM Thymidine再次同步化18h。
3.?樣品收集：
1)?分別收取釋放2h(S期)，6h(G2/M期)和12h(G1期)細胞樣品。
2)?每個樣品收取都使用預冷的PBS洗滌4次，1000g離心5min，棄上清。
3)?100μl PBS重懸沉淀，吸取出細胞懸液于移液器中，于移去細胞的管中加入900μl預冷的70%乙醇，漩渦振蕩器震蕩中滴入細胞懸
液。
4)?4℃固定一小時或更長時間。
5)?1500rpm，離心10min，去固定液。
6)?細胞染色液配制：50×RNase A 母液：50×PI母液：PBS=20：20：960；RNase A 母液濃度1mg/ml，工作濃度20μg/ml；PI母液濃度2.5mg/ml，工作濃度50μg/ml。
7)?37℃染色1h。根據細胞量，加入一定體積的細胞染色液（1~1.5ml）重懸，使上機時細胞通過率為200~350Cell/s，染色液不可過多或過少，過多則細胞密度過低上機速度嚴重不足，過少則導致細胞粘結。
8)?300目篩網過濾至流式管中。
4.?上機檢測：
流式細胞儀上機檢測，計數50000個細胞。
5.?同步化數據分析：
數據使用ModFit軟件分析。

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四、?實驗結果

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?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 圖1. HeLa S3細胞同步化結果

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?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 表1. HeLa S3細胞同步化各周期比例??

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????????????????????????????????????????????????????????????????????????? ?圖2. HeLa S3細胞同步化各周期比例

結論：從圖1實驗結果可以看到Thymidine可以有效的將HeLa S3細胞同步化在G1/S期（release 0hr），釋放量2h后細胞進入S期，釋放6h后，細胞進入G2/M期，釋放12h以后細胞重新進入G1期。表1和圖2的統計分析可以發現，同步化后大于92%HeLa S3細胞處于S期，在釋放12h以后同步進入G1期的細胞依然可以達到82%以上。

五、?參考文獻
1.?Loewe H, Urbanietz J. Arnzeimforsch, 24:1927, 1974.
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