T7 High Yield RNA Transcription Kit使用說明書

產品描述                                                     

T7 High Yield Transcription Kit對體外轉錄體系進行了優化，能以帶有T7啟動子的線性化質粒、PCR產物或合成的DNA片段等為模板，在較短時間內通過體外轉錄反應獲得大量RNA，操作簡單便捷。

本試劑盒轉錄合成的RNA可用于體外翻譯、顯微注射、RNA保護實驗、探針雜交、RNAi和RNA結構和功能研究等。試劑盒NTP是單獨提供，便于根據自己需求，在底物中加入修飾的核苷酸，制備生物素或染料標記的RNA。

運輸和保存

干冰運輸，-20℃保存。

產品組分

產品用途

體外RNA合成

注意事項

1、為了避免RNase污染，實驗中請穿實驗服，戴一次性手套和口罩，使用RNase-Free耗材。

2、實驗所用DNA模板建議先純化，以避免RNase、蛋白及鹽離子殘留對反應體系的影響。

3、Transcription Buffer (10×)中含有亞精胺，在低溫條件下會使DNA模板沉淀，需在室溫條件下配制反應體系。

4、如果需要合成地高辛、生物素等標記的RNA或特殊標記的RNA，請自備相應的修飾NTP。如果需要合成加帽RNA，請自備帽結構或帽類似物。

模板制備

推薦使用以下幾種類型的模板，模板可用TE緩沖液或RNase-free Water溶解。

1、質粒模板

帶T7啟動子的質?？梢宰鳛檗D錄模板，質粒的線性化程度和純度會影響轉錄的產量及RNA的完整性。環狀質粒由于沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物，為了得到特定長度的RNA，質粒必須完全線性化，線性化的質粒請確保雙鏈為平末端或5’端為突出結構。

注：

a、RNase、鹽離子、蛋白等會對轉錄反應產生影響，為提高轉錄實驗的穩定性，建議質粒線性化后進行純化，再作為模板使用。

b、為確保轉錄產物長度與預期一致，建議質粒酶切后切膠回收目的片段，以獲得高純度長度單一的線性化模板。

2、PCR產物模板

帶T7啟動子的PCR產物可以作為體外轉錄模板。PCR擴增模板時將T7啟動子（TAATACGACTCACTATAGGG）加在非編碼區的上游引物的5’端。PCR產物可直接作為模板，無需純化，但純化后可以獲得更高產量的RNA。

注：

a、擴增完需要通過瓊脂糖凝膠電泳確定產物的特異性和產量。

b、為了獲得更多的RNA，建議對PCR產物純化后作為模板。若電泳條帶單一，可以使用PCR產物回收試劑盒純化PCR產物后作為模板。若條帶不單一，建議對目的條帶切膠回收，回收產物作為模板。

3、合成的DNA模板

合成的帶有T7啟動子的DNA片段也可以作為體外轉錄的模板。

實驗流程

轉錄方案

圖一 RNA轉錄方案

體外轉錄

1、試劑解凍：將Transcription Buffer (10×)室溫下解凍和放置。將試劑盒其他組分振蕩混勻，短暫離心收集于管底，冰上儲存備用。

2、按下表比例配制反應體系。

注：

a、Transcription Buffer (10 ×)中含有亞精胺，在低溫條件下會使DNA模板沉淀，因此，需在室溫條件下配制反應體系。

b、若果進行多個反應，可以先混勻除模板和RNase Free Water以外的組分，分裝到各個管里，再加入模板。

c、反應體系通常為20 μL，可以根據需要按比例放大或縮小體系。

d、對于長模板（>1000 bp），建議使用線性化質粒作為模板。

e、推薦每20 μL體系使用0.1-1 μg模板。

3、混勻、離心、37℃反應2-3 h。

注：

建議使用PCR儀孵育，避免體系蒸發對實驗造成影響。

4、(選做）向反應體系中加入1 μL Dnase I (1 U/μL)，37℃孵育15 min，消化DNA模板。

5、合成的RNA經電泳分析后純化，用RNase-free Water稀釋至合適濃度，可用于下游實驗。

產物純化

1、酚/氯仿純化

a、加入160 μl RNase-free Water將產物稀釋至180 μl。

b、加入20 μl 3 M的醋酸鈉（pH 5.2）到稀釋后的產物中，用移液器充分混勻。

c、加入200 μl的酚/氯仿混合液（1：1）進行抽提，室溫10000 rpm離心5 min，將上層溶液（水相）轉移至新的RNase-free EP管中。

d、加入與水相等體積的氯仿抽提2次，收集上層水相。

e、加入2倍體積的無水乙醇并混勻，-20℃孵育至少30 min，4℃ 15000 rpm離心15 min。

f、棄上清并加入500 μl預冷的70%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃ 15000 rpm離心，棄上清。

g、開蓋干燥2 min，加入20-50 μl RNase-free Water或其他緩沖液溶解RNA沉淀。

h、-80℃保存。

2、氯化鋰純化

a、20 μL體系中分別加入30 μL RNase Free Water和30 μL Lithium Chloride Precipitation Solution (7.5 M)，使Lithium Chloride的終濃度在2.5-2.8 mM之間。

b、-20℃放置至少30 min（可以放置過夜）。

c、12000 rpm離心15 min，去上清，收集沉淀。

d、用預冷的70%乙醇洗2次，每洗一次，離心5 min，倒棄液體，收集沉淀。

e、晾干RNA，RNase-free Water溶解后檢測。

3、柱純化

柱純化可以去除蛋白和游離核苷酸。

純化前加入80 µl RNase Free Water將產物稀釋至100 µl，再按柱純化說明書進行純化。

4、磁珠純化

磁珠純化可以去除蛋白和游離核苷酸。

按磁珠純化說明書進行純化。

RNA分析與定量

1、凝膠電泳分析：轉錄產物可以使用變性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分析，評估產物的長度、完整性以及產量。

2、紫外吸收法進行RNA定量：游離核苷酸會影響定量的準確性，采用此方法前請先進行RNA純化。

3、染料法進行RNA定量：用RiboGreen染料進行RNA定量，游離核苷酸不會影響定量，可以對純化或者未純化的反應產物中的RNA進行準確定量。

常見問題及解決方案

1、轉錄產物產量低

①實驗組模板中含有抑制反應的成分

建議：重新對模板進行純化，確定模板量及其完整性。

②實驗模板序列本身原因

建議：加大模板投入量；延長反應時間；換用其他啟動子和RNA聚合酶進行轉錄。

2、短片段轉錄產量低

轉錄產物小于0.3 kb時，可以通過延長反應時間（4 h-過夜反應）或增加模板量來提高RNA產量。

3、RNA產物片段與預期不符

（1）RNA產物片段小于預期

①模板序列中包含類似于T7 RNA聚合酶的終止序列。

建議：嘗試不同的RNA聚合酶。

②模板中GC含量高形成高級結構。

建議：可以加入SSB蛋白，以提高轉錄效率，或者使用42℃進行轉錄會提高轉錄產物的產量。

③RNase污染。

建議：實驗過程中戴口罩、戴一次性手套并注意更換手套。使用一次性無酶槍頭、EP管。實驗試劑使用前離心，避免試劑在瓶蓋或管口導致污染，開蓋要小心，避免污染。

（2）RNA產物片段大于預期

①若是以線性化質粒為模板，可能質粒模板沒有完全線性化，或者有義鏈3'端為突出結構。質粒作為模板必須完全線性化，即使存在小量的未線性化模板，也可能產生大量的長片段RNA產物。

建議：重新線性化質粒，要確保線性化完全，并檢查模板結構，確保有義鏈3'端不能是突出結構。

②RNA存在未完全變性的二級結構。

建議：使用變性膠來檢測RNA產物。

4、產物電泳拖尾現象

①轉錄及純化過程被RNase污染

建議：使用RNase-free的槍頭和EP管，實驗中所用試劑都為RNase-free，戴一次性乳膠手套。

②電泳過程中被RNase污染

建議：電泳緩沖液用RNase-free Water配制，電泳槽和制膠器具用RNase-free Water浸泡，縮短電泳時間。

③DNA模板被RNase污染。

建議：重新純化模板DNA。

僅供科研實驗使用