細胞描述

該細胞系已廣泛用于創建基因敲除小鼠。HPRT負突變使該品系可用于染色體工程。已經表明該小鼠ES細胞系具有生殖能力。

細胞特性

1） 來源：小鼠，129S5/SvEvBrd（原129/SvEvBrd）品系，小鼠胚胎內細胞團

2） 形態：球形克隆 貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規格：1mL凍存管包裝

5） 用途：僅供科研使用

運輸和保存

干冰運輸：1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

一．培養基及培養凍存條件準備

1）準備DMEM 基礎培養基              (iCell-0001)                 81.5%      

      優質胎牛血清                             （iCell-0500）               15 %

      GlutaMAX-1谷氨酰胺                  (iCell-0900)                 1 %

      MEM NEAA非必需氨基酸         (iCell-01000)                1%

      P/S青霉素-鏈霉素                  （iCell-15140-122）          1%

      β-巰基乙醇                                      (iCell-8211)                 1.25 mL

      LIF                                                 (iCell-50756)                 10ng/mL

注意：

1、建議使用CF-1  MEF作為飼養層細胞。

2、在鋪胚胎干細胞前，需對MEF進行處理，具體處理步驟見下文絲裂霉素滅活MEF。

3、該細胞建議凍存干冰發貨，不適合長時間活細胞運輸，會影響細胞活力。

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：完全培養液 60%%，FBS 30%%，DMSO 10%%現用現配。

我庫凍存時，體積為 500 μl，預期存活率 70%，每支凍存管的細胞復蘇，3 至4 天后，會形成 30 至 40 個克隆，建議復蘇至 1 個 T25 培養瓶中。

二：細胞處理

絲裂霉素滅活MEF：

待MEF細胞密度達到80%以上，加入含絲裂霉素（15μg/mL）的MEF完全培養液，置于37培養箱中孵育2.5h，2.5h后，棄掉培養液，PBS清洗1-2遍，加入MEF培養基，備用，當天2h后或者第二天可以傳入小鼠胚胎干細胞。

復蘇：

1.將小鼠胚胎干細胞凍存管從液氮中取出，置于 37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超凈臺內用 75%酒精擦拭凍存管旋口處及外壁，防止污染。

2. 將凍存管內細胞懸液轉移至含 3-4 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液的 15ml 離心管內，以 1000 rpm，離心 5 min。

3. 離心后將上清液吸除，另加入新鮮的小鼠胚胎干細胞完全培養液 2 ml，吹打懸浮。

4. 重復吹打，制成單細胞懸液，盡量避免氣泡。

5.  轉移至 1 個已經鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中培養。

6. 每天更換小鼠胚胎干細胞完全培養液。

傳代：

1. 一般在復蘇后第 2-3 天傳代，視克隆大小和密度而定

2. 吸除廢液。

3. 用 PBS（不含鈣鎂離子）輕輕沖洗一遍。

4. 加入 1.0 ml 的 0.25%胰酶（含 EDTA）至培養瓶，輕輕晃動，使胰酶覆蓋底面，置于 37℃培養箱內消化細胞。

5. 在顯微鏡下觀察，直至細胞層全部脫落（一般需要 1-2 min）。

6.  加 2 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液終止消化。

7.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清。

8. 加入約 1 ml 小鼠胚胎干細胞完全培養液，多次輕輕吹打細胞， 制成單細胞懸液。

9. 加入足量的小鼠胚胎干細胞完全培養液，吹打混勻，細胞懸液分裝到鋪好 MEF 細胞的 T25 培養瓶中。一般地，一個 T25 培養瓶加入 5-6 ml 培養液。放入 37℃培養箱內培養。每天換液。

傳代比例：1:4-1:7

凍存：

1.按傳代的方法將細胞消化下來，制成細胞懸液。

2.  以 1000 rpm，離心 5 min，棄上清，逐滴加入已經預冷的凍存液，懸浮細胞。

3. 按每支存管內加入 500 ml 細胞懸液分裝到凍存管內，標記細胞名稱、代數、凍存日期等基本信息。

4．將凍存管置于程序降溫盒內，-80℃過夜，轉入液氮。

凍存液配方：

小鼠胚胎干細胞完全培養液 60%，ES 級 FBS 30%，DMSO 10%

附：小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞分離的簡易方法（差速貼壁法）：

1.培養中的小鼠胚胎干細胞，按傳代的操作方法將細胞用胰酶消化并吹打成單細胞懸液后，加入適量的提前溫育好的小鼠胚胎干細胞完全培養液重懸細胞， 吹打混勻，細胞懸液分裝到無 MEF 細胞的培養皿或培養瓶（一般地，一個T25 培養瓶中培養的小鼠胚胎干細胞，在一個 10 cm 培養皿中進行差速貼壁。不要事先鋪明膠，如鋪明膠則細胞貼壁速度過快無法有效分離小鼠胚胎干細胞與 MEF 細胞）中。

2. 培養皿或培養瓶置于 37°C 培養箱內靜置 1 小時。

3.  1 小時后，絕大部分 MEF 細胞已貼在培養皿或培養瓶底面，而大部分小鼠胚胎干細胞仍然懸浮在培養液中。收取培養液，進行后續實驗。