狂犬病毒（RV）簡介

狂犬病毒（rabies virus，RV）屬于彈狀病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒屬（Lyssavirus）。野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，在神經系統中具有傳播屬性，對人和動物均具有較高致病性。隨著反向遺傳學手段的成熟，經過改造的RV，可用于神經回路研究。RV感染中樞系統后，主要標記神經元，幾乎不標記膠質細胞；被感染的神經元在一定時間內（7-12天）幾乎不發生明顯病變及裂解。Wickersham 等基于RV疫苗株Sad B-19感染性克隆構建的復制缺陷型重組RV具有較低的毒性和較高的安全性，可清晰的標記神經元的精細形態，并通過反向互補策略實現了對神經網絡聯接的逆向跨單級突觸追蹤。
RV逆行及跨單突觸原理
RV的囊膜糖蛋白（glycoprotein，G）是其逆行跨突觸所必需的蛋白，其受體大量分布在軸突末端，感染后可沿軸突逆行進入神經元胞體開啟病毒復制，G蛋白缺失的RV（RV-ΔG）會喪失跨突觸能力，而其復制及轉錄不受影響（可持續高豐度表達外源基因），因此，RV-ΔG攜帶報告基因后，其功能類似CTB，retrobeads等，可逆向高亮度標記神經元精細形態。另外，補償RV-G蛋白，可輔助RV-ΔG逆行跨突觸感染上一級神經元，從而實現跨單突觸神經網絡標記。
? 利用重組的禽類肉瘤病毒（Aviansarcoma-leukosisvirus，ASLV）的外膜蛋白（EnvA）融合蛋白包裝RV形成的病毒粒子，可特異性識別EnvA的受體TVA（TVA只存在于禽類細胞中，在哺乳動物神經元中無表達）介導病毒特異性地感染細胞。利用Cre轉基因鼠結合Cre-LoxP控制表達TVA及G蛋白的AAV輔助病毒，可實現只在特定區域特異類型神經元中表達TVA及G蛋白，從而利用RV-EnvA-ΔG實現對特異類型神經元的逆向跨單級突觸標記（如圖1）。

圖1. A：跨單級RV改造原理； B：RV逆行跨單級突觸標記示意圖 （Arenkiel BR et al. Nature. 2009.）

滴度檢測

病毒滴度單位為IFU/ mL（infectious units per mL），表示每毫升病毒能有效感染的靶細胞數目。病毒滴度采用梯度稀釋法測定。

圖2. RV樣品制備細胞圖（以RV-ΔG-dsred為例）

應用實例
適應的神經科學問題
1) 特定單個區域特異類型神經元的全腦單級輸入網絡標記。
2) 兩個區域特異類型神經元跨單級輸入網絡標記。
3) 三級連接網絡的跨單突觸標記。

應用舉例

圖3. RV-EnvA-ΔG-dsRed結合AAV helper實現神經元跨單突觸標記，在兩側海馬、丘腦背外側核（LD）、丘腦前背側核（AD）、丘腦室旁核（PVA）等腦區都能看到紅色熒光蛋白標記的神經元

生物安全性
利用RV示蹤工具病毒進行相關神經回路標記實驗，對實驗員的病毒使用經驗及生物安全環境有較高要求。動物實驗的流程及樣本取材實驗必須在生物安全二級（BSL-2）實驗室中完成，并符合病毒操作相關規程。

參考文獻：
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