產品簡介

TUNEL（TUNEL Apoptosis Detection Kit, Alexa Fluor 488）細胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細胞在晚期凋亡過程中細胞核DNA的斷裂情況。檢測原理：在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）的作用下，基因組DNA斷裂時暴露出的3´-羥基（3´-OH）末端摻入Alexa Fluor 488-12-dUTP，因此可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。Alexa Fluor 488染料穩定性更高，信號更強，從而使標記物更亮，抗淬滅能力更強。

本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。

產品規格

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒儲存在-20℃，Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix避光儲存于-20℃，有效期為1年。

注意事項

1. 需自備用于洗滌細胞的PBS，用于封片的抗熒光淬滅封片液，用于固定的4%多聚甲醛。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. 本產品僅用于科研。

使用說明

1. 樣品準備

1. 石蠟包埋組織切片

1. 室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡5 min，重復一次，以徹底脫掉石蠟。
2. 室溫下用100%乙醇浸泡切片5 min，重復一次。
3. 室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗1次，每次3 min。
4. 用PBS輕輕潤洗切片，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
5. 按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6. 每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育20 min。

【注】Proteinase K幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結果，可能需要優化Proteinase K孵育的時間。

1. PBS溶液潤洗樣本2-3次，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保持樣本濕潤。

1. 組織冰凍切片

1. 取出冰凍切片，并回溫至室溫。將玻片浸沒在4%多聚甲醛溶液（溶于PBS）中固定，室溫下孵育30 min。
2. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。
3. 將玻片浸沒在PBS溶液中，室溫孵育15 min，重復PBS洗一次，共2次。
4. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
5. 按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6. 每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育10 min。

【注】Proteinase K幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優化Proteinase K孵育的時間。

1. 在盛有PBS溶液的敞口燒杯中潤洗樣本2-3次。

【注】為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失，建議不用洗瓶清洗，而是將玻片浸在PBS溶液中2-3次進行清洗。

1. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本的濕潤。

1. 細胞爬片的準備

在Lab-Tek載波片小室（Chamber Slides）上培養貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后，用PBS洗2遍載玻片。

1. 細胞涂片的制備（以多聚賴氨酸包被的載玻片為例）

1. 以約2×10⁷個細胞/mL的濃度將細胞重懸于PBS中，吸取50-100 μL細胞懸液滴于多聚賴氨酸包被的載玻片上，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。
2. 固定細胞，將載玻片浸入裝有4%新鮮配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25 min。
3. 洗滌載玻片，將其浸入PBS中，室溫放置5 min。重復用PBS洗一次。
4. 輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。這時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥，處理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。
5. 按1:100的比例，用PBS作為稀釋液來稀釋2 mg/mL的Proteinase K溶液，使其終濃度為20 μg/mL。
6. 每個樣本上滴加100 μL濃度為20 μg/mL的Proteinase K溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育5 min（也可浸于0.2%配制于PBS中的Triton X-100溶液中，室溫孵育5 min進行通透處理）。

【注】Proteinase K幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。未得到更好的結果，可能需要優化Proteinase K孵育的時間。

1. PBS潤洗樣本2-3次，輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中。

1. DNA酶處理陽性對照的步驟

在樣本通透處理后，用DNA酶I處理細胞來準備陽性對照載玻片。該流程通常會引起被處理的大多數細胞顯現綠色熒光。

【注】DNA酶I處理固定的細胞會引起染色體DNA的斷裂，產生許多可標記的DNA 3´-末端。

1. 按1:10的比例用去離子水稀釋10×DNase I Buffer(每個樣本需用200 µL 1×DNase I Buffer，即需要用20 µL 10×DNase I Buffer和180 µL去離子水混合稀釋)，取其中100 µL滴加到已通透的樣本上，室溫孵育5min。 向剩余100 μL 1×DNase I Buffer中加1 μL DNase I (1U/μL)，使其終濃度為10 U/mL。
2. 輕輕叩掉液體，加入100 μL含10 U/mL DNase I 的緩沖液，室溫孵育10 min。
3. 輕叩載玻片，去掉多余的液體，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗3-4次。

【注】陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸，否則陽性對照載玻片上殘余的DNase I 可能會在實驗載玻片上引入高背景。

1. 標記與檢測

1. 按1:5的比例用去離子水稀釋適量5×Equilibration Buffer（每個樣品需要100 μL 1×Equilibration Buffer）。
2. 每個樣本滴加100 μL 1×Equilibration Buffer使其全部覆蓋待檢樣本區域，室溫孵育10-30 min。或者將載玻片放入一個含有1×Equilibration Buffer的缸中，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同時在冰上解凍Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，準備足夠量的用于所有實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液。對于面積小于5 cm²的一個標準反應，其體積是50 μL，用50 μL乘以實驗和陽性對照反應的數目來確定所需TdT孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣本，可成比例的增大試劑體積。

表1 準備用于實驗的和可選陽性對照反應的TdT孵育緩沖液

陰性對照體系：準備一份不含TdT酶的對照孵育緩沖液，用ddH₂O替代TdT酶。

1. 在平衡后的區域周圍用吸水紙洗掉100 μL 1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在5 cm²面積的細胞上加入50 μL TdT孵育緩沖液。不要讓細胞干掉。這之后的操作，載玻片要避光。
2. 把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于濕盒內，在37℃孵育60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。

【注】塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

1. 移除塑料蓋玻片，并將切片置于PBS溶液中室溫孵育5 min，換用新鮮PBS再重復清洗2次。
2. 用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。

【注】為了降低背景，載玻片在用PBS洗一遍后，可再用含0.1% Triton X-100和5 mg/mL BSA的PBS洗3次，每次5 min，這樣游離的未反應的標記物可以清楚較干凈。

1. 樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有PI溶液（1 μg/mL，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置5 min。（可選）：樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有DAPI溶液（2 μg/mL，用PBS新鮮配制并稀釋）的染色缸，室溫放置5 min。
2. 洗滌樣本，將載玻片浸入去離子水中，室溫放置5分鐘。重復兩次，總共洗三次。
3. 叩干載玻片上多余的水并向樣本區域加100 μL PBS保持樣本濕潤。
4. 立即在熒光顯微鏡下分析樣本，用標準的熒光過濾裝置在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光；在＞620 nm下觀察PI的紅色熒光，或在460 nm觀察藍色的DAPI。如有必要，載玻片能在4℃黑暗條件下存放過夜。

【注】PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix摻入而定位的綠色熒光。

1. 利用流式細胞術檢測懸浮細胞

1. 將3-5×10⁶個細胞用PBS在4℃離心（300×g）洗兩次，4℃ 300 g離心10 min，然后重懸在0.5 mL PBS中。
2. 固定細胞，加入5 mL 1%配制于PBS中的多聚甲醛溶液，冰上放置20 min。
3. 細胞在4℃ 300×g離心10 min，去上清并且重懸于5 mL PBS。重復洗一次，并用0.5 mL PBS重懸細胞。
4. 通透細胞，加入5 mL冰上預冷的70%乙醇，在-20℃孵育4小時。細胞能在70%乙醇中-20℃條件下保存一周，或者細胞可用配制于PBS中的0.2% Triton X-100溶液通透，室溫放置5 min。
5. 細胞在300×g離心10 min，并用5 mL PBS重懸。重復離心，并1 mL PBS重懸。
6. 轉移2×10⁶個細胞至一個1.5 mL的微量離心管。
7. 300×g離心10 min，去上清，并用80 μL 1×Equilibration Buffer重懸。室溫孵育5 min。
8. 在平衡細胞的同時，在冰上融解Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix，并依照表1，準備足夠量用于所有反應的TdT孵育緩沖液。對于2×10⁶個細胞的一個標準反應，其體積是50 μL，50 μL乘上反應數目即所需TdT孵育緩沖液的總體積。
9. 細胞在300×g離心10 min，去上清并把沉淀重懸在50 μL TdT孵育緩沖液中，37℃孵育60 min，避光。每隔15 min用微量移液器輕輕重懸細胞。
10. 加入1 mL 20 mM EDTA終止反應，用微量移液器輕柔混勻。
11. 300g離心10 min，棄上清并把沉淀重懸在1 mL配制于PBS中的0.1% Triton X-100溶液，其中含5 mg/mL BSA，重復一次，總共洗2次。
12. 300 g離心10 min棄上清，細胞重懸于0.5 mL用PBS新配制的5 μg/mLPI溶液中，其中包含250 μg無DNA酶的RNA酶A。
13. 在黑暗中室溫孵育細胞30 min。
14. 用流式細胞儀分析細胞，在520±20 nm的熒光下觀察綠色熒光；在＞620 nm下觀察PI的紅色熒光。PI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色，只在凋亡的細胞核中才有Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix摻入而定位的綠色熒光。