2018 年 10 月，10X Genomics 推出的 Chromium 單細胞 ATAC 解決方案提供了一種全面的、可擴展的方法來研究分析單個樣本中成百上千個細胞中染色質的開放情況。通過轉座酶對混合的細胞核懸液進行核 DNA 的切割，然后使用微流控芯片將溶液中的細胞核包裹到油滴中，形成納米級的凝膠珠狀乳狀液（GEMs）。采用 10X 條形碼，對每個細胞核切割的 DNA 加上條形碼。通過文庫構建，測序，根據 10X 條形碼將測序得到的序列關聯到每個單獨的細胞核上。

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1、轉座酶切割核 DNA

細胞核懸浮液在包括轉座酶的混合液中孵育。轉座酶進入細胞核，優先在染色質的開放區域將 DNA 片段化。同時，將測序接頭序列添加到片段化的 DNA 片段的末端。

圖 轉座酶切割 DNA 示意圖

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2、GEM 生成及 Barcode 添加

在 Chromium Next GEM Chip H 芯片上，使包含有 barcode 的凝膠珠，轉座酶切割后的細胞核，混合液（包括 ATAC buffer 和 ATAC 酶），以及油滴進行混合，生成 GEMs。為了達到每個油滴中包含有單個細胞核，需要對細胞核進行有限稀釋，保證生成的大多數 GEMs(~90-99%) 不包含細胞核，而其余的為包含單個細胞核 GEMs。

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GEMs 生成后，凝膠珠會溶解釋放出含有（i) Illumina P5 序列、(ii) 16nt 10X 條形碼序列和（iii) Read 1 (Read 1N) 序列的寡核苷酸。這些核苷酸序列會于片段化的 DNA，以及混合液進行混合。后續經過熱循環后生成含有 10X barcode 的單鏈 DNA。經過孵育后，對 GEMs 進行破油處理，所有 GEMs 中的含有 10X barcode 的單鏈 DNA 混合在一起，并進行回收。

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3、破油后的純化

使用硅烷磁珠清除破油反應混合物中殘留的生化試劑。固相可逆固定（SPRI) 珠子用于從樣本中消除未使用的 10X 條形碼。

4、測序文庫的構建及質檢

通過 PCR 將 P7 接頭以及樣本的標簽（Index N）添加到文庫的兩端，形成包含有 P5 和 P7 接頭序列的文庫，用于 Illumina 橋式 PCR 擴增。

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文庫結構

圖  ATAC 文庫組成示意圖

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通過 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 對文庫進行質檢，結果如下：

圖 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 文庫質檢結果

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或者用  Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 來檢測片段大小，結果如下：

圖 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 質檢結果

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備注：

a、橫坐標表示文庫的片段程度，其中 0 代表核小體 free 的峰。1 代表包含有一個核小體的峰；2 代表包含有 2 個核小體的峰；以此類推。

b、核小體是由 DNA 和組蛋白形成的染色質基本結構單位。每個核小體由 146bp 的 DNA 纏繞組蛋白八聚體 1.75 圈形成。核小體核心顆粒之間通過 50bp 左右的連接 DNA 相連。加上兩端的 P5,P7 接頭，barcode，sample index，R1N 序列，長度大概如下：核小體 free 的峰長度 200 多 bp；1 個核小體的峰約為 300 多 bp；2 個核小體的峰約為 500bp，以此類推。

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建議測序深度及參數

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▲流程精簡時效快： 可檢測單細胞轉錄調控區域中的開放性染色質。

▲通量高： 每個通道 500-10000 個細胞核。

▲效率高： 細胞核捕獲率高達 65%。

▲適用范圍廣： 經驗證適用于原代細胞，凍存細胞，新鮮組織等。

▲信息分析： 獲取信息量大，可精細化分析。

▲同一份樣本可實現單細胞 ATAC、mRNA、TCR/BCR 同時測序，并整合數據。

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▲類型： 新鮮組織，原代細胞，細胞系等。

▲來源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

▲樣本量及其它質控要求：

▲樣本的保存與運輸：

（1）細胞懸液：建議現場制備，如要運輸，建議使用伯豪生物自主研發的單細胞保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運輸，2 小時內送達伯豪生物實驗室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發的單細胞 ATAC-seq 組織保護液，4°C 運輸，48 小時內送達伯豪生物實驗室。

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