螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）是一種分子量約為61 kDa的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，能夠催化螢光素（luciferin）氧化成oxyluciferin，在氧化的過程中會發出波長為560 nm左右的生物螢光。海腎螢光素酶（Renilla luciferase）是一種分子量約為36 kDa的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化腔腸素（coelenterazine）氧化成coelenteramide，在氧化的過程中會發出波長為480nm左右的生物螢光。兩種生物螢光都可通過化學發光儀進行測定。檢測原理如圖所示：

圖1：螢火蟲和海腎螢光素酶檢測原理圖

通常將目的基因的5´UTR或啟動子克隆至Firefly Luciferase的上游，或3´UTR克隆至Firefly Luciferase的下游，通過檢測螢火蟲螢光素酶的量來檢測啟動子或調控元件的轉錄調控作用。Renilla Luciferase作為內參，來消除細胞數量、轉染效率等的差異。Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit首先以螢光素為底物來檢測螢火蟲螢光素酶報告基因的活性，之后在淬滅該螢光反應的同時，以腔腸素為底物檢測海腎螢光素酶報告基因的活性。該試劑盒具有靈敏度高的特點。

裂解能力更強：能夠徹底裂解絕大部分種類細胞。

信號更強：能夠精準檢測弱啟動子的表達。

線性范圍更廣：線性檢測范圍超過酶濃度的8個數量級。

1、產品性能和進口產品一致

圖1展示了螢火蟲螢光素酶發光強度、淬滅效果以及海腎螢光素酶發光強度的對比情況。翌圣11402雙熒光素酶報告基因檢測產品在發光強度方面與進口品牌P表現相當。同時，在螢火蟲螢光素酶的淬滅效果上，翌圣11402同樣與進口品牌P不相上下，且顯著優于其他國產品牌。此外，翌圣11402的熒光殘留量極低，幾乎可以忽略不計，這使得其完全不會對海腎螢光素酶的再次發光產生任何影響，從而保證了實驗結果的準確性和可靠性。

2、信號更加穩定

圖2 翌圣11402雙熒光素酶報告基因檢測產品Firefly luciferase螢光信號穩定性（動力學）檢測結果顯示，從反應初始時刻起持續追蹤Firefly luciferase螢光信號長達30分鐘，發現翌圣11402的螢光信號幾乎無衰減，信號穩定性表現出色，遠超常規機器操作所需時長，能夠充分滿足實際檢測需求。

3、凍融5次對產品信號基本無影響

圖3 翌圣11402雙熒光素酶報告基因檢測產品在經過5次反復凍融處理后，檢測其Firefly luciferase和Renilla luciferase螢光信號，結果顯示信號強度幾乎不受影響，穩定性極高。這一特性使其在實驗室環境中更具實用性，能夠更好地滿足日常使用需求。

干冰運輸。 -20℃保存，有效期1年。

螢火蟲螢光素酶反應工作液和海腎螢光素酶反應工作液現配現用，且不能反復凍融，建議分裝-20℃或-80℃分裝保存。

Q：細胞裂解之后的裂解液能否在-80℃保存？

A：可保存在-80℃，基本與蛋白的保存方法類似。裂解后的樣本可在 -80 ℃保存半年，-20 ℃保存一個月。

Q：雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒中的兩個底物是否需要避光的？

A：這兩個底物操作過程中不需要嚴格避光。保存的時候避光保存，更重要的保存條件是低溫，尤其是腔腸素，推薦-80℃保存。

Q：雙熒光素酶報告基因載體共轉染時比例該如何進行優化與調整？

A：比例：根據具體實驗情況進行調整。建議做預實驗：如海參載體與螢火蟲載體比例分別用 1:10、1:20、1:50、1:100。螢火蟲熒光素酶檢測發光值大于海參熒光素酶發光值的比例比較好。

Q：海腎和螢火蟲是在同一個孔里面檢測嗎？螢火蟲的螢光不會影響海腎的螢光嗎？能否分開檢測呢？

A:同一個孔里檢測。不會相互影響，我們的海腎熒光素酶底物中有淬滅螢火蟲熒光值的物質。可以分開檢測，但是在一個孔里檢測會更加準確。

Q：使用的是promega的儀器進行檢測，發現海腎的本底值偏高很多，是為什么呢？

A：我們的產品與promega的儀器不適配，會導致本底值偏高。建議使用酶標儀檢測。

Q:檢測螢火蟲熒光素酶，酶標儀使用什么樣的板子呢？

A：白色不透明的酶標板。

Q：裂解液不夠用了，怎么辦呢？

A：10ml PBS里加入0.3ml Triton。

Q：如遇使用細胞裂解液對細胞樣本裂解后，后續使用BCA方法檢測蛋白存在背景較高的情況該如何處理？

A：對細胞裂解樣本進行5倍稀釋后再檢測。

Q: 為啥11402試劑盒里要裂解細胞，40901這個單獨的底物不需要？

A: 1、熒光素酶是表達在細胞內，是一種不存在于人類物種的水解酶（所以本底很低），它不能透膜。熒光素酶的底物是環狀小分子，是疏水的，因而可以透膜的，因此只要存在熒光素酶表達，那必然是外源的，那么將底物加到細胞培養基中或打到體內均能得到信號。

2、報告基因體外檢測需要細胞裂解是為了避免細胞轉染異質性、底物滲透不均勻和信號不均一而強行勻質化的做法。體外報告基因檢測是一個定量且靈敏度很高的實驗，報告基因檢測需要ATP和氧氣的存在，裂解細胞是需要把表達的熒光素酶完全釋放出來，能夠有更好的反應，因為細胞內的氧氣含量有限，如果不裂解，會導致信號一定程度的降低（有的裂解液也做了一些優化，比如額外加了ATP以提高信號等）。因此報告基因體外檢測裂解細胞能夠有更好的信號；

3、活體成像，檢測儀器功率大，能夠透過皮膚，細胞，有更強的穿透力，因此可以不用裂解細胞就可以檢測到很強的熒光信號，還有就是活體成像檢測比較糙，精準度都是相對的。

Q：當海腎作為主報告基因時檢測的順序是否可以調整呢？

A：不可以調整。在該檢測試劑盒中，其中組分B螢火蟲螢光素酶緩沖液無論對于螢火蟲熒光素酶還是海腎熒光素酶的檢測都至關重要，海腎螢光素酶的最適反應環境需要有組分B的存在，否則會出現海腎熒光素酶檢測值非常低的情況。

當僅需要檢測海腎熒光素酶時，也需要加入組分B，這樣才能保證最適反應環境檢測到正確的結果。

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