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?使用美國AB公司的9700 PCR System為主的多種PCR裝置。

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? 一，原理與應用

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甲基化是在DNA甲基轉移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用

S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧

啶嘧啶環的五號碳原子上加上甲基的共價修飾過程。DNA甲基化修飾現象廣泛存在于

多種有機體中，是最早發現的修飾途徑之一，是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組

成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改變DNA的一級結構，但是能引起染色質結構、

DNA 構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而在基因的表達及

其調控、DNA的復制、細胞的生長發育、X染色體失活、衰老以及許多人類疾病(如發

育畸形、癌癥、心血管疾病、糖尿病和神經心理失調等)發生過程中發揮重要作用。

?? ?DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N⁶- 甲基腺嘌呤及7-甲基鳥嘌呤。

在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多發于CpG二核苷酸序列中，基因組中60%-90%的

CpG是甲基化的。在甲基轉移酶(DNMT)的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)

提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧

啶極易在進化中丟失，高等真核生物中CpG序列遠遠低于其理論值，但在基因組的某

些區域中，通常是基因的啟動子和第一外顯子區，CpG序列密度很高，可以達均值

的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島。哺乳類基因組中約

存在4萬個CpG島，大多位于轉錄單元的5’區。CpG島的高甲基化是腫瘤中存在的普

遍現象，而啟動子CpG 島的高甲基化是除突變和缺失外腫瘤中抑癌基因失活的第三種

機制。因此，基因啟動子甲基化檢測在臨床診斷、藥物敏感性檢測等方面具有很高的

應用價值。

二，?服務項目

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三， 檢測方法

???? 亞硫酸鹽修飾克隆測序法，巢式PCR法，熒光定量PCR法

四，?Real Time PCR裝置

??? 使用美國ABI公司的9700 PCR儀和Step-one PLUS System為主的PCR裝置。

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?五，?服務項目說明?

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1，?亞硫酸鹽測序法?(bisulfite sequencing PCR, BSP)

??????? 先抽提基因組DNA，再進行亞硫酸鹽修飾，甲基化PCR后裝克隆，通過最后對PCR產

物進行克隆測序，可以得到目的片段中每個CG位點的甲基化情況，這種方法更加準確，所以

目前BSP法受到更多研究者的青睞！

最后通過對測序結果分析, 可以得到如下數據:

1.? 測序序列與目的序列的相似度（%）

2.? C-T轉化效率（%）

3.? 目的序列中每個CG的甲基化情況（點狀圖）

4.? 目的序列中每個CG的甲基化比例（%）

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????????????????????????????????????????????????????? 點狀圖

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柱狀圖（百分比）

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?序列比對

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2，甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR，MSP)

????????甲基化特異性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改進方法是檢測基因甲基化的經典方法．

MSP法的原理是首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶都被轉化為尿嘧啶，而

甲基化的胞嘧啶則不變。然后設計針對甲基化和非甲基化序列的引物并進行聚合酶鏈反應(PCR)擴增，最后

通過瓊脂糖凝膠電泳分析，確定與引物互補的DNA序列的甲基化狀態。

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3，QMSP分析

??????????? QMSP采用熒光定量的方法，可確切定量出甲基化的比例。詳情請電聯我們的技術服務人員。

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?4，服務要求

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1.? 如果您需要進行此項服務,請電話聯系我們公司或發送E-mail給我們。
2. ?請寄送足量的并且保證純度的基因組DNA(濃度在500 ng/μl以上，體積在 20 μl以上)。
3. ?如果提供的材料為細胞或組織，DNA的提取費用另收。 同時應保證材料新鮮，動物細胞

數為10⁶以?? 上，動物組織為100 mg以上。