不用連接酶內切酶定向構建任何載體試劑盒
產品名稱： 不用連接酶內切酶定向構建任何載體試劑盒
英文名稱：
產品編號： K01
產品價格： 0
產品產地： shanghai china
品牌商標： willget
更新時間： null
使用范圍： null
上海文淵閣生物科技有限公司
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Cloneget克隆系統?
????? 本試劑盒為非內切酶依賴的克隆系統，可快速和高通量的將PCR產物定向克隆到任何載體中，只需將200bp到15kb的PCR片段與線性化的載體混合，用本試劑盒提供的專有酶處理30分鐘后即可轉化，陽性率在95%以上。(具體原理見下圖)?
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主要特色:?
1,?快速，定向的克隆PCR產物，陽性克隆比例高（95%以上）。?
2，PCR產物與線性化載體無需酶切，去磷酸化處理，適合高通量克隆。?
3，可有效克隆15kb的DN**段。?
4，如果長片段不易PCR擴增獲得，可將次長片段分解為2-4個較短片段分別擴增，每個片段首尾重疊15bp核苷酸，利用本試劑盒可將這些片段首尾連接形成全長片段，并克隆到載體中。?
試劑盒組分：?
Cloneget?Enzyme?????10?μl??
5X?Cloneget?Buffer?????50?μl??
Manual?????1??
本試劑盒-20°C條件下，保質期為一年??
使用方法：?
A.????線性化質粒的制備?
線性化質?？赏ㄟ^PCR擴增，單酶切，或雙酶切制備。質粒的線性化不徹底將導致陰性克隆的產生，所以一般建議通過雙酶切或PCR擴增的方法進行質粒線性化。如使用PCR擴增獲得線性化質粒，所用的Taq酶應選用高保真酶（如pfu酶）。??
B.????目標DNA的PCR擴增?
利用PCR擴增目標DNA,所用的Taq酶應盡量選用高保真酶（如pfu酶）。利用本試劑盒克隆目標DNA，需要目標DNA的兩端含有與載體兩端相同的15bp核酸，所以設計引物時要將的這15bp的核酸加到特異性引物5’端，具體設計見下圖：?
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C.????目標DNA與載體的重組?
1．????將下列混合物小心加到0.5ml的eppendorf管的管底，或PCR管的管底。（如果不慎將液體粘在管壁，請務必通過短暫離心使其沉入管底）。?
線性化載體?????????????????????????????????0.03?～?0.1?pmol?
純化的PCR產物?????????????????????????????0.06?～?0.2?pmol??
5X?Cloneget?Buffer?????????????????????????2?μl?
Cloneget?Enzyme???????????????????????????0.5?μl?
去離子水??????????????????????????????????補足10μl?
一般來說，反應體系中多添加一些PCR產物，會使陽性克隆增多，較長的PCR片段要增加其添加量，以維持其適當摩爾數目。對于不同大小的PCR片段，建議加入下列體積：?
2.將其混合物在25°C保持30分鐘，之后在冰上保持5分鐘。?
3.可立即進行轉化，也可-20°C保存，以后再轉化。?
D.????轉化?
轉化前請自行準備42°C?水浴，SOC液體培養基，DH5α?感受態細胞(>1×108?cfu/μg)?
1.冰上融化一管50?μl的感受態細胞，輕彈管壁使細胞重懸起來。加入5μl到8μl的反應液到感受態細胞中，輕彈數下，置冰上孵育30分鐘。?
2.42°C水浴中熱激45?90秒，冰上孵育2分鐘。加800μl不含抗生素的SOC，37°C孵育45min。?
3.6000?rpm離心2分鐘收集菌體，用100μlSOC液體培養基重懸菌體。?
4.將菌體均勻的涂布在含抗生素平板上。?