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人缺失BRCT結構域PES1過表達載體構建

摘要：以人cDNA為模板擴增PES1基因，通過搭橋PCR缺失BRCT結構域(Δ322–415)后替換慢病毒對照載體pLenti-CMV-EGFP- 3FLAG-PGK-Puro中的EGFP。該載體骨架中3FLAG與目的基因融合表達以利于后續的表達檢測和Western Blot研究，而puromycin抗性基因則利于穩定細胞株的篩選。該載體既可用于瞬時轉染細胞，也可以包裝成慢病毒用于穩定株的篩選以及在動物水平過表達，來研究缺失BRCT結構域對PES1蛋白功能的影響。
關鍵詞：PES1， BRCT， Δ322–415，過表達， 3FLAG， puromycin， lentivirus vector

一、?實驗原理
PES1的BRCT結構域為第322-415氨基酸序列，研究缺失了這個BRCT結構域對蛋白功能的影響。PCR擴增PES1(Δ322–415)基因序列，構建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro載體中CMV啟動子后面的EcoR I和Xba I多克隆位點，目的基因代替了對照載體的EGFP基因。
pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro載體圖譜如下：

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二、?實驗目的
構建既可用于瞬時轉染又可用于穩定株篩選的人PES1(Δ322–415)過表達慢病毒載體。

三、?實驗方法
PCR擴增的PES1(Δ322–415)基因序列與經由EcoR I和Xba I酶切的表達載體pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重組后轉化E.coli? DH5α感受態細胞。
菌落PCR篩選到的陽性克隆送測序。經驗證無誤的進行質粒抽提。實驗步驟如下：
1.?引物設計：
從GenBank中查詢目的基因以及上下游的序列，用Vector NTI軟件進行引物設計。
PCR擴增目的基因：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴增目的基因，反應體系和條件如下：

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2.?瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果：
目的基因PCR擴增成功后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過和DNA Marker的對比，判斷目的基因是否擴增成功。
3.?膠回收目的基因片段：
把目的基因條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?線性化表達載體的制備：
用限制性內切酶對表達載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10 x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的基因同源重組到線性化表達載體中：
?????????????????????????????將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比1:1:1加到離心管中進行重組反應：
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混勻后在42℃孵育30min，然后轉移到冰上。放置2-3min后取10μl反應液體轉化到感受態細胞中。
6.?感受態細胞的制備和轉化：
DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

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8.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
9.?質粒小提：
測序通過的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、?實驗結果
1.?PCR擴增目的基因：
目的基因片段a的擴增：用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGGAGGCCTTGAGAAGAAG（含同源重組序列、EcoR I酶切位點、Kozak序列，并含有目的基因5’端配對序列用于PCR擴增目的基因），反向引物GCTGCACCCCCTCCTGCGCCTCCAGCTCC（擴增目的基因1-322氨基酸序列），對人cDNA進行擴增，預期PCR產物大小為999bp。
目的基因片段b的擴增：用正向引物? GGCGCAGGAGGGGGTGCAGCTGCCCCCACAC（擴增目的基因415-588氨基酸序列），反向引物CCAGACGCGGTCTAGATCACTCCGGCCTTGCCTTCTTG（引物說明：含同源重組序列、Xba I酶切位點，并含有目的基因3’端配對序列用于PCR擴增目的基因）對人cDNA進行擴增，預期PCR產物大小為552bp。
電泳結果如下：
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1.?a片段PCR產物
3.?b片段PCR產物
2.4?? DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp

2.?表達載體的線性化：
用EcoR I和Xba I對表達載體進行雙酶切，得到810bp和6.9kb的片段，回收6.9kb的載體片段。酶切圖譜如下：?
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1.?載體雙酶切片段
2.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3.?菌落PCR鑒定陽性克隆：
用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物EPS1-SEQF：GGTCTTCCTGTCCATCAAAG位于目的基因序列中，反向引物WPRE-R：CATAGCGTAAAAGGAGCAACA位于WPRE序列中，陽性克隆得到1039bp的片段。電泳結果如下：
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1.?陰性對照（ddH2O）
2.?陽性性對照（其他插入片段）
3.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11. 挑取的8個轉化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。經測序驗證正確的，再接種抽提質粒。

4.?測序結果分析：
陽性克隆測序結果表明，和預期序列完全一致。按要求缺失了第322-415氨基酸序列的BRCT結

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五、?參考文獻
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社

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