Frdbio ?細胞凋亡檢測試劑盒

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一.產品說明

在正常細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V 是一種分子量為35~36kD 的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故

可通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。將Annexin V 進行熒光素（EGFP、FITC）標記，以標記了的Annexin V 作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀可檢測細胞凋亡的發生。

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二.產品保存方法

各組分應在2-8℃條件下避光保存，有效期2年。

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三.使用方法

1. 懸浮細胞離心（2000rpm 離心5min）收集；貼壁細胞用不含EDTA 的胰酶消化收集（注：胰酶消化時間不易過長，否則容易引起假陽性）；

2. 用PBS 洗滌細胞二次（2000rpm 離心5min）收集1-5×10⁵ 細胞；

3. 加入500μL 的Binding Buffer（FrdE00017-2）懸浮細胞；

4. 加入5μL Annexin V-FITC（FrdE00017-1） 混勻后，室溫避光，反應15-30min;

5. 用PBS 洗滌細胞一次（2000rpm 離心5min），500μL PBS 重懸細胞；

6. 室溫，避光，孵育5min，上機檢測。

7. 注：請在1 hour 內，進行下述熒光顯微鏡或流式細胞儀的觀察和檢測。

a. 熒光顯微鏡觀察

1) 滴一滴上述染色后的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞；

2) 對于貼壁細胞來說，也可直接用蓋玻片來培養細胞并誘導細胞凋亡；

1 將細胞于蓋玻片上生長，用適當的凋亡誘導劑誘導細胞凋亡，并設立陰性對照組；

2 用PBS 洗滌細胞兩次；

3 在500μL 的Binding Buffer 中加入5μL Annexin V-FITC 混勻；

4 將上述溶液滴加于蓋玻片表面，使蓋玻片表面均勻覆蓋；

5 避光、室溫反應5 min。

3) 將蓋玻片倒置于載玻片上，于熒光顯微鏡下濾光片（FITC）觀察，Annexin V-FITC 熒光信號呈綠色。

b. 流式細胞儀分析

1) 用流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm; 發射波長Em=525nm。Annexin V-FITC 的綠色熒光通過

FITC 通道（FL1）檢測。

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四.注意事項

1. 微量試劑取用前請離心集液。

2. Annexin V-FITC 避光保存及使用。

3. 本試劑盒適用于檢測活細胞，流式細胞儀檢測時，細胞數量不應低于1×10⁵，，不推薦用于檢測組織樣本。

4. 推薦使用懸浮培養細胞。如果是貼壁細胞，需用不含EDTA 的胰酶消化，如消化不當，可能引起假陽性，而用細胞刮子會造成細胞粘連成團，而影響檢測。可將胰酶消化后細胞的保存在含2%BSA 的PBS 中，防止進一步的損傷。

5. 細胞固定后可能導致熒光的淬滅，請不要固定樣品。

6. 因檢測細胞的類型、凋亡誘導劑種類、使用的檢測儀器不同，因而流式檢測的熒光補償也不同，因此建議每次檢測均需使用未經凋亡誘導處理的細胞作為對照，進行熒光補償的調節。

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*本試劑僅供實驗室研究使用