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組蛋白巴豆酰化（histone crotonylation, Kcr）是一種新型的組蛋白翻譯后修飾（PTM），首次發現于2011年。與乙酰化（acetylation, Kac）相比，Kcr不僅在調控基因表達上具有獨特作用，還可能參與細胞代謝狀態感知，因此在表觀遺傳學和代謝組學交叉研究中越來越受到關注。在分析組蛋白巴豆酰化時，常用質譜（MS）結合免疫富集的方法，以實現高靈敏度和特異性檢測。

一、樣本準備

1、樣本類型

• 細胞株：如HEK293、Hela等，可進行處理實驗。
• 組織樣本：新鮮或冷凍組織，需避免蛋白降解和去修飾。
• 培養條件：巴豆酸或丁酸處理可增強巴豆酰化信號，便于檢測。

2、核蛋白提取

巴豆酰化主要存在于組蛋白上，核蛋白富集是關鍵步驟：

• 細胞裂解 → 獲取核沉淀。
• 使用高鹽或酸性提取組蛋白。
• 蛋白定量后，進行后續酶切或免疫富集。

組蛋白含有大量賴氨酸殘基，巴豆酰化通過添加一個4碳的羧酸鏈修飾賴氨酸，使得組蛋白帶負電荷，影響染色質結構與轉錄活性。

二、蛋白消化策略

質譜分析前需將蛋白切成可分析的肽段：

1、酶切選擇

• 胰蛋白酶（Trypsin）：常用，但Kcr修飾可能阻礙賴氨酸切割。
• Lys-C：對修飾賴氨酸更友好，可減少漏切。

2、消化優化

• 可以聯合酶切（Lys-C + Trypsin）提高覆蓋率。
• 保證pH和溫度條件適宜，防止Kcr水解。

巴豆酰化相對乙酰化穩定性稍高，但仍需避免高溫和強酸過度處理。

三、修飾肽富集

由于巴豆酰化在組蛋白中占比低，直接MS檢測靈敏度有限，需要特異性富集：

1、免疫富集

• 使用高特異性抗-Kcr抗體。
• 結合磁珠或瓊脂糖珠進行肽段富集。

2、選擇性化學捕獲（較少用）

• 一些方法使用化學標簽與Kcr反應，提高質譜檢測效率。

免疫富集相當于在“海量肽”中用“磁鐵”抓取特定“帶巴豆鏈的肽”，極大提高檢測靈敏度。

四、LC-MS/MS 檢測

1、儀器選擇

• 高分辨質譜：Orbitrap 或 Q-Exactive 系列最常用。
• 液相色譜（LC）：納升級反相色譜（nano-RP-LC）可提高分離能力，減少復雜背景干擾。

2、數據采集模式

（1）DDA（Data Dependent Acquisition）

• 常用于發現性分析。
• 依賴強度選擇肽段碎片。

（2）DIA（Data Independent Acquisition）

• 可提高重復性和覆蓋率。
• 對定量研究尤其有用。

3、MS參數優化

• 分辨率 ≥ 60,000（MS1），碎片化能量需優化（HCD常用）。
• 對巴豆酰化修飾應設置動態修飾 + 42.0106 Da（巴豆酰基質量）。

巴豆酰化肽的質譜信號比乙酰化肽稍微弱，優化碎片化能量可以顯著提高識別率。

五、數據分析

1、軟件工具

• MaxQuant / Proteome Discoverer：支持Kcr標記搜索。
• Spectronaut 或 DIA-NN：適合DIA數據處理。

2、分析重點

• 修飾位點定位（確保高概率定位）。
• 蛋白-修飾肽定量（LFQ或TMT標記）。
• 差異分析：比較處理 vs 對照組，識別顯著上調/下調Kcr位點。

3、生物學解讀

• 富集的通路分析（如KEGG、GO）。
• 與轉錄調控或代謝狀態相關聯。
• 可結合其他組學數據（乙酰化、甲基化、代謝組）多維度解讀。

六、百泰派克生物科技的技術優勢

在實際應用中，百泰派克生物科技提供全流程Kcr分析服務，包括：

• 高覆蓋組蛋白修飾譜：Orbitrap質譜 + 優化免疫富集。
• 多樣本定量比較：支持TMT或LFQ定量。
• 個性化報告：整合KEGG/GO富集及可視化熱圖。

組蛋白巴豆酰化（Kcr）分析通常包括樣本準備、組蛋白提取、酶切、修飾肽富集、質譜檢測和數據分析幾個關鍵步驟。首先，從細胞或組織中快速提取核蛋白并純化組蛋白，避免修飾丟失；隨后使用Lys-C或胰蛋白酶酶切蛋白，同時優化條件以提高Kcr肽覆蓋率；然后通過高特異性抗-Kcr抗體進行免疫富集，提高質譜檢測靈敏度；在LC-MS/MS分析中使用高分辨率Orbitrap質譜結合納升級液相色譜，設置動態巴豆酰修飾搜索以識別和定量肽段；最后通過MaxQuant或Proteome Discoverer進行修飾定位、定量和差異分析，并結合生物信息學進行通路和功能注釋。百泰派克生物科技在此流程中提供從樣本處理到高覆蓋Kcr譜圖的全流程技術支持，能夠幫助科研人員高效、可靠地解析組蛋白巴豆酰化在基因調控與代謝狀態中的作用。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統對蛋白質序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對蛋白質的氨基酸組成分析，N端測序，C端測序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白質N端序列分析服務。對于未知理論序列的蛋白質，提供基于從頭測序法的蛋白質從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、蛋白質組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量蛋白質組學、靶向蛋白質組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種蛋白質組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規模實驗分析，發現新的生物標記物;

2.體內體外多種蛋白質標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.專業生物信息學分析，分析更系統準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，最后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優勢：

1.技術先進，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現了數量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從最小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從蛋白質、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產品變異性和純度分析。旨在提供優質生物藥物分析服務，幫助生物醫藥生產商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等專業服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

4.七大質量控制檢測平臺，滿足您一站式服務需求；

5.服務3000+企業，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優質的生物質譜分析服務!

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