單核細胞無血清培養基
產品名稱： 單核細胞無血清培養基
英文名稱： Monocyte serum-free medium
產品編號： 05-080-1
產品價格： 0
產品產地： 以色列
品牌商標： Biological industries（BI）
更新時間： null
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?1 ?人外周血單個核細胞分離
1.1 ?轉移血液樣品
人工采集外周血50-100ml，用酒精棉球擦拭血袋外表面后放入生物安全柜。預先打開2個50ml離心管，用止血鉗夾住血袋引流管的中部，剪刀在引流管中部靠外剪斷引流管，將血液平均轉入兩個50ml離心管中，旋緊蓋子。
1.2 ?血細胞富集
將上述裝好轉移到50ml離心管中的血液離心。條件為2000rpm×，8min，20℃。離心后將上層血漿轉移到一新的離心管中，留下沉淀細胞。
1.3 ?用人淋巴細胞分離液分離單個核細胞
估計血細胞體積，按體積比1：1用生理鹽水懸浮血細胞。新打開2個50ml離心管，每管加入適量的人淋巴細胞分離液（總體積約為細胞懸液體積的1/2，每管15ml左右）。用25ml的移液管把血細胞懸液緩緩加入到有人淋巴分離液的離心管中。注意血液要加到淋巴分離液的上層，勿打破人淋巴分離液的界面。將加好的血細胞液放入離心機離心。條件為2000rpm×20min，20℃，降速設置為零。
1.4 ?收集單個核細胞
將上述離心好的樣品緩緩放入生物安全柜，對光照可以看到樣品在離心管里分成四層，從上到下依次為生理鹽水和少量血漿層、單個核細胞層、淋巴分離液層、粒細胞紅細胞層。用10ml移液管小心吸棄生理鹽水和少量血漿層，然后小心將單個核細胞層吸出轉移到1個50ml離心管中。
1.5 ?單個核細胞洗滌
向收集單個核細胞的離心管中添加生理鹽水到45ml，旋緊蓋子顛倒混勻，20℃，進行3次梯度離心洗滌，收集細胞沉淀。條件依次為1800rpm×8min； 1500rpm×8min； 1200rpm×8min。
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2 ?單核細胞貼壁分離
2.1 ?將上述離心后的細胞沉淀用2ml無血清培養基懸浮混勻，吸取20ul細胞懸液計數。
2.2 ?根據細胞數量，添加無血清培養基稀釋細胞懸液，使細胞終濃度為 3×106個/ml。
2.3 ?將細胞懸液分加到6孔板中，每孔3ml。將6孔板送入CO2培養箱中培養。培養條件為5%CO2，60min。
2.4 ?取出六孔板，在生物安全柜中用10ml移液管小心吹打六孔板中液體，吸出未貼壁細胞置 50ml離心管中。向六孔板每孔緩緩加入2ml生理鹽水， 再將生理鹽水小心吸出，收集合并到上述50ml離心管中， 離心（1200rpm×min，8min，20℃）后可作為DC細胞培養。
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3 ?自體血漿滅活
將裝有自體血漿的離心管放在56℃水浴鍋中孵育30min，每10min振蕩搖勻一次。滅活后的血漿離心，條件為2500rpm×10min，20℃。棄掉沉淀，將上層血漿轉移到一個新的離心管中。
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4 ?單個核細胞誘導成樹突狀細胞（DC）
4.1 ?按需要配制誘導培養基，培養基ml數=六孔板孔數×4ml,在培養基里面添加GM-CSF，終濃度100ng/ml，IL-4終濃度100ng/ml，添加1%的自體血漿。
4.2 ?
d0 ?每孔添加2ml的誘導培養基，放入培養箱培養。
d2 ?每孔添加1ml的誘導培養基，放入培養箱培養。
d4 ?每孔添加1ml的誘導培養基，放入培養箱培養。
d5 ?添加TNF-α，終濃度25ng/ml。放入培養箱培養. 觀察細胞形態并記錄。
d7 ?收集細胞計數并留樣做流式檢測。用5ml移液管吹打六孔板，收集細胞培養液到50ml離心管中，離心，1500rpm×8min，20℃。
備注：每天觀察培養基的顏色變化、細胞形態并作相應記錄。
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