將冷凍組織切片放置在空間轉錄組芯片的捕獲區域內，進行 HE 染色和成像后，對組織切片進行透化處理，細胞內的 mRNA 釋放，從而被芯片上帶有 oligo-dT 的探針捕獲，并且每個探針都帶有特異的位置信息（Spatial barcode），然后以 mRNA 為模版進行 cDNA 合成，構建文庫后再通過測序，獲得基因表達信息的同時，每一條測序 reads 因帶有 Spatial barcode，從而能夠獲得基因表達的位置信息。

▲圖 空間轉錄組技術的原理

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空間轉錄組技術包含兩種芯片，分別為組織優化芯片（Tissue Optimization）和基因表達芯片（Library Preparation）。組織優化芯片用來摸索組織透化的時間，基因表達芯片用來進行正式樣本的空間轉錄組實驗。其中基因表達芯片上有 4 個捕獲區域，每個區域大小為 6.5mm×6.5mm，每個捕獲區域中有 5000 個帶有特異地址序列的探針簇，稱為 barcoded spots，每個 spot 直徑為 55um，包含數百萬個用于捕獲的 oligo 探針序列，相鄰兩個 spot 的中心距離為 100um。探針序列的結構為：測序引物結合序列，16nt 的位置序列，12nt 的 UMI 序列以及 30nt 的 oligo-dT 序列。

▲圖 空間轉錄組兩種芯片

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▲圖 空間轉錄組基因表達芯片工作原理

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▲圖 空間轉錄組測序實驗流程

方法一：組織冷凍（不常用）

1、異戊烷和液氮浴：如圖所示，不銹鋼燒杯內倒入異戊烷至 2 / 3 體積，然后將不銹鋼燒杯放入液氮中（與異戊烷液位相同），孵育 15 分鐘。

2、新鮮樣本可用 PBS 沖洗，去除殘留血液，然后使用實驗室紙巾吸干組織表面多余的血液或液體，防止冰晶的形成（注：組織長和寬不可超過 6mm±0.2mm，否則后續實驗無法貼片）。

3、用鑷子或刮刀將組織整體浸沒在異戊烷中，直至整體冰凍（注：冷凍時間可根據組織類型和大小而改變）。

4、冷凍后，取出組織轉移到預冷的密封容器中，干冰轉移至 -80°長期保存或立即進行下一步（注：為防止組織樣品蒸發和脫水，冷凍的組織樣品必須儲存在密封容器中以長期保存）。

方法二：冷凍組織包埋（常用）

1、粉狀干冰：用研缽和杵準備干冰粉。

2、冷凍 OCT：將 OCT 放在冰上≥30 分鐘（注：OCT 請使用指定品牌）。

3、預冷鑷子：將鑷子放在干冰中≥30 分鐘。

4、包埋盒上需標記組織樣本的方向（注：在添加 OCT 和組織之前，需先在包埋盒上標記，因為一旦凍結，OCT 將迅速變成白色，這使得以后很難確定組織方向）。

5、用冷卻的 OCT 鋪平包埋盒底部，避免產生氣泡。

6、從不銹鋼燒杯中取出冰凍的組織，加入到 OCT 的包埋盒中心位置，繼續倒入 OCT 覆蓋樣本。需避免氣泡產生，尤其在組織附近。

7、立即將含有組織和 OCT 的包埋盒放在干冰粉上，直至整體凍結（約 20min 以上）。

8、將包埋盒放置到密封袋中，干冰運輸。

注意事項

1、新鮮組織樣本包埋

目前新鮮組織的包埋方法有兩種，一種是液氮 + 異戊烷法；另一種的干冰法。對于臨床手術切下來的組織樣本一般使用干冰的包埋方法。對于穿刺樣本等一些較小，較輕的樣本，一般推薦用液氮 + 異戊烷的方法進行冷凍。OCT 包埋組織塊可以在–80ºC 的密封容器中長期保存，或立即進行冷凍切片。

2、冷凍切片切、組織樣本質控及貼片

由于空間轉錄組檢測的是組織中的 RNA，因此要對切片中的 RNA 質量進行檢測。我們一般取 10 片組織切片進行 RNA 抽提并質檢，確定組織中 RNA 完整性（RIN>7）。所以要求我們的組織樣本要保證可以切到至少 20 片 10um 厚度的切片，以便完成所有的實驗。

3、組織優化

組織優化的目的是摸索樣本的透化條件，保證組織切片中的 mRNA 能夠充分釋放。該步驟是獲取真實實驗結果的必要條件。否則，我們無法判斷是基因表達高低到底是因為透化不充分導致的，還是實際就是這個樣子。因此：每個樣本建議都要做透化，尤其是臨床樣本。

4、成像

應使用 Visium Imaging Test Slide 驗證成像設置。明場成像基準框和基準標記應清晰可見，并使用 Brightfeld 設置聚焦。Visium Imaging Test Slide 四個區域（A1，B2，C1，D2）具有熒光斑點，可通過 TRITC 和 Cy5 flter cubes 檢測到，熒光設置應清晰可見 A1，B2，C1 和 D2 中的熒光點，且熒光點信號應從左到右減小。

5、正式實驗

正式實驗時要對反轉錄后的 cDNA 長度分布，濃度和量進行判斷。cDNA 的長度分布在~200bp-9000bp 之間，在 1000bp 左右會有峰值（不同的組織類型會有些許差異）。

6、測序

在捕獲區域，每個組織覆蓋的 spot 建議至少測 50000 read pairs。整個捕獲區域共有 5000 個 spots。可以根據組織貼到芯片上后，覆蓋芯片的大小來判斷測序的數據量。

計算公式（Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot  例如：組織覆蓋了 60% 的區域，則數據量為（0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。

圖   切片覆蓋芯片區域百分比

常見空間轉錄組的應用方向主要在腫瘤學，免疫學，發育生物學，神經科學及病理學等方向。

▲圖   空間轉錄組的應用方向

▲表    已做過優化的樣本類型

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