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在臨床研究和轉化醫學領域，福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE, Formalin-Fixed Paraffin-Embedded）組織樣本因其長期穩定保存和豐富的臨床信息，成為極具價值的生物資源。然而，FFPE樣本在用于LC-MS蛋白質組學分析前，必須解決一個關鍵技術難題，即實現高效且具有良好重復性的去蠟處理（deparaffinization）。

一、為什么FFPE樣本必須去蠟？

FFPE樣本制備過程中，組織會經過福爾馬林固定和石蠟包埋。石蠟的存在雖然有助于結構保存，但對蛋白質組學分析卻帶來多重干擾：

• 阻礙蛋白提取：石蠟形成疏水屏障，影響裂解液滲透
• 抑制酶解反應：殘留石蠟會影響胰蛋白酶活性
• 污染質譜系統：石蠟成分可能導致LC-MS系統污染和信號抑制

因此，徹底去除石蠟是FFPE蛋白質組學樣本前處理的第一步，也是決定數據質量的關鍵因素之一。

二、FFPE去蠟的基本原理

去蠟的核心原理基于“溶劑相似相溶”：

• 石蠟屬于非極性物質
• 需使用非極性有機溶劑（如二甲苯）進行溶解
• 隨后通過梯度乙醇逐步去除溶劑并復水

這一過程不僅是物理去除石蠟，同時也是為后續蛋白提取創造合適的水相環境。

三、經典去蠟方法：二甲苯法

1、標準流程

目前最常用的方法是二甲苯（xylene）去蠟法，其典型步驟如下：

（1）二甲苯脫蠟

• 加入1 mL二甲苯
• 室溫振蕩10分鐘
• 離心（14,000 g, 5 min）
• 去除上清
• 重復2次

（2）梯度乙醇洗滌

• 100%乙醇（2次）
• 95%乙醇
• 70%乙醇
• 每步離心并棄上清

（3）水化處理

• 加入去離子水或緩沖液
• 準備進入蛋白裂解步驟

2、方法優勢

• 去蠟效率高
• 適用于絕大多數FFPE樣本
• 技術成熟、重復性好

3、方法局限

• 二甲苯具有毒性
• 多步操作可能導致樣本損失
• 對低豐度蛋白有一定影響

四、替代去蠟方法：無二甲苯策略

隨著蛋白質組學技術的發展，研究人員逐漸探索更溫和、高效的去蠟方案。

1、熱裂解去蠟法（Heat-induced deparaffinization）

利用高溫（通常95°C以上）配合裂解緩沖液實現石蠟溶解：

（1）優點

• 簡化流程（一步完成去蠟+裂解）
• 減少樣本損失

（2）缺點

• 對部分蛋白可能造成降解
• 對緩沖體系要求較高

2、有機溶劑替代（如Heptane）

部分實驗使用正庚烷（heptane）或其他低毒溶劑替代二甲苯：

• 毒性更低
• 對蛋白結構影響較小

但目前應用尚不如二甲苯廣泛。

3、表面活性劑輔助法

使用SDS、SDC等表面活性劑：

• 直接乳化石蠟
• 與SP3、FASP等蛋白質組流程兼容

五、去蠟后關鍵步驟：蛋白提取與交聯逆轉

去蠟只是第一步，FFPE樣本還面臨另一個核心問題，即甲醛交聯（formalin crosslinking）。

1、交聯逆轉策略

通常采用：

• 高溫（95°C以上）
• 強變性劑（如SDS、urea）
• 長時間孵育（1-2小時）

2、蛋白提取優化

關鍵因素包括：

• 裂解緩沖液組成
• 超聲或高壓輔助裂解
• 蛋白回收方法（SP3、S-Trap等）

六、影響去蠟效果的關鍵因素

在實際實驗中，去蠟效果直接影響蛋白質組數據質量，需重點關注以下因素：

1、樣本厚度

• 切片過厚會影響溶劑滲透
• 推薦5-10 μm

2、去蠟時間

• 時間不足會殘留石蠟
• 時間過長可能導致蛋白損失

3、離心效率

• 不充分離心會影響分層
• 建議≥14,000g

4、溶劑純度

• 低純度溶劑可能引入污染

七、LC-MS蛋白質組學中的最佳實踐建議

為了獲得高質量FFPE蛋白質組數據，建議遵循以下優化策略：

1、標準化流程

確保每批樣本使用一致的去蠟和處理條件。

2、結合自動化平臺

減少人為誤差，提高重復性。

3、使用高靈敏度質譜系統

提升低豐度蛋白檢測能力。

4、數據質量控制

包括：

• 肽段覆蓋度
• 蛋白鑒定數量
• 重復性評估

八、FFPE蛋白質組學的應用前景

隨著去蠟及前處理技術的不斷優化，FFPE樣本正在成為蛋白質組學的重要來源：

• 腫瘤標志物發現
• 回顧性臨床研究
• 精準醫學研究
• 空間蛋白質組學

其與LC-MS的結合，為臨床樣本深度挖掘提供了前所未有的機會。

FFPE組織的去蠟處理看似基礎，卻是決定LC-MS蛋白質組學成敗的關鍵環節。從傳統二甲苯法到新興的無溶劑策略，技術的不斷演進正在顯著提升數據深度和可靠性。對于希望開展高質量FFPE蛋白質組研究的科研人員而言，選擇合適的去蠟方法并優化整體流程至關重要。百泰派克生物科技依托先進Orbitrap質譜平臺與優化的FFPE前處理流程，實現高深度蛋白鑒定、優異數據重復性及卓越臨床樣本適配能力，為腫瘤研究與轉化醫學提供一站式蛋白質組學解決方案。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統對蛋白質序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對蛋白質的氨基酸組成分析，N端測序，C端測序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白質N端序列分析服務。對于未知理論序列的蛋白質，提供基于從頭測序法的蛋白質從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、蛋白質組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量蛋白質組學、靶向蛋白質組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種蛋白質組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規模實驗分析，發現新的生物標記物;

2.體內體外多種蛋白質標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.專業生物信息學分析，分析更系統準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，最后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優勢：

1.技術先進，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現了數量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從最小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從蛋白質、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產品變異性和純度分析。旨在提供優質生物藥物分析服務，幫助生物醫藥生產商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等專業服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

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5.服務3000+企業，10000+客戶的選擇；

6.致力于為您提供優質的生物質譜分析服務!

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