Y1HGOLD 酵母感受態細胞

保存條件：-80℃。

1.產品簡介：

Y1HGold菌株是GAL4-AbA酵母單雜系統用菌株，MATα型，可直接轉化質粒進行篩庫試驗。Transformation marker為：ura3， leu2；報告基因為：AbAr。Y1HGold-GAL4-AbA 酵母單雜系統需要兩種質粒配套使用：pAbAi 和PGADT7。質粒pAbAi的篩選標志為URA，用于表達pBait-AbAi construct (1~3個bait DNA序列 重復串聯后克隆到pAbAi中)；質粒pGADT7的篩選標志為LEU，用 于表達AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)與目標蛋白 (Prey)的融合蛋白。此外AbAr與營養缺陷報告基因相比具有更低背景的優點，可降低酵母單雜假陽性發生的概率。Y1HGold感受態細胞經特殊工藝制作，pGADT7質粒檢測轉化效率>10⁴ cfu/μg DN

基因型：MATα, ura3-52, his3-200, ade2-101, trp1-901, leu2-3, 112, gal4Δ, gal80Δ, met–, MEL

2.使用說明：

1).取pBait-AbAi質粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收：

2).取一支無菌的1.5ml EP管，依次加入預冷的目的質粒1-3μg,Carrier DNA 10μl(95-100℃ 5min快速冰浴，重復一次)，100μl冰.上融化的Y1HGOLD感受態細胞，PEG/LiAc 500ul， 輕輕翻轉混勻6-8次;

3).30℃ 水浴30min，每10min輕輕翻轉混勻6-8次;

4).每支加入20ul的二甲基亞砜; (用于提高轉化效率，可不做)

5).42℃水浴15min，每5min輕輕翻轉混勻6- 8次;

6).12000rpm瞬時離心棄上清,每支加入1m1的YPD Plus于30℃復蘇1h; (用于提高轉化效率， 可不做)

7).12000rpm瞬時離心棄上清，用100ul 0.9% NaCl 重懸，涂板,30℃培養48 - 96h。

3.注意事項：

1).PEG溶液在低溫環境下會析出，請于常溫下完全溶解后使用。

 2).轉化高濃度的質?？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。

3).同時轉化2-3種質粒時可增加質粒的用量。

 4).Y1HGold酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為27-30℃；高 于31℃，生長速度和轉化效率呈指數下降。

5).菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現象。當細胞在平板培養幾天后，平板上的Adenine被酵母消耗完畢，酵母 試圖通過自身代謝途徑合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold 的ADE2基因被破壞，Adenine合成途徑受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中間產物P-ribosylamino imidazole（AIR）在細胞中積累而使菌落變為粉紅色。

 6).酵母在缺陷培養基中生長速度比YPDA培養基慢，培養基中缺 陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂YPDA平板29℃， 48h培養可見直徑1mm克?。煌縎D單缺平板29℃，48-60h培養可 見直徑1mm克隆，涂SD雙缺平板29℃，60-80h培養可見直徑1mm 克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培養可見直徑1mm克隆

*本試劑僅供實驗室研究使用