一、高性能基因編碼鈣離子探針——jGCaMP7

? ? ? ?利用基因編碼鈣指示劑(genetically encoded calcium indicators,GECIs)測量神經元活動已成為神經科學中廣泛使用的方法，GECIs進行鈣成像通常用于測量完整神經系統的神經活動，如檢測大量神經元胞體的活動，或追蹤神經元亞細胞(如軸突、樹突和單個突觸)的動態。盡管取得了重大進展，但鈣成像仍然受到現有GECIs的生物物理特性的限制，包括親和力、信噪比、靈敏度、半衰期以及動態范圍，因此，GECIs在這些方面還有待改進。 2019年6月17日，來自霍華德休斯醫學研究所的Karel Svoboda、Loren Looger?和 Vivek Jayaraman等課題組合作的“GENIE項目組”在頂級期刊《Nature Methods》上發表了題為“High-performance calcium sensors for imagingactivity in neuronal populations and microcompartments”的研究成果。該論文系統地介紹了新一代基因編碼的鈣離子探針jGCaMP7系列，專門用于檢測特定環境下的神經元活動。jGCaMP7包括:jGCaMP7s(靈敏)、jGCaMP7f(快速動力學)、jGCaMP7b(較亮的基線熒光)和jGCaMP7c(高對比度)。jGCaMP7在體內和體外都進行了測試，其性能明顯優于GCaMP6。
? ? ? ? ?研究人員利用在存在或不存在Ca2+時GCaMP的晶體結構，確定了可能影響指示劑關鍵性質的位置，包括靜息熒光和峰值熒光，以及結合和不結合Ca2+的親和力和動力學。GCaMP包括一個與鈣調蛋白(CaM)融合的環狀排列GFP(cpGFP)和一個來自肌球蛋白輕鏈激酶(Rs20，也稱為M13)的鈣調蛋白結合肽。鈣調蛋白依賴的構象變化及其與M13和GFP的相互作用調節GFP發色團環境并影響熒光。對GFP-CaM接口和CaM-M13相互作用接口進行了定點突變(圖1a)。通過電極刺激培養的神經元篩選662個變異的jGCaMP7(圖1c)，繼續在體外特性研究中得到了性能優良的jGCaMP7s、jGCaMP7f、jGCaMP7b和jGCaMP7c。其中，jGCaMP7s靈敏性可達GCaMP6s的5倍以上，且速率也快于GCaMP6s；jGCaMP7b靈敏度達到GCaMP6s3倍，熒光亮度增強50%；jGCaMP7c靈敏度是GCaMP6s的2.7倍，且對比度增強；jGCaMP7f反應速率是GCaMP6f 的5倍及GCaMP6s的3倍(圖2)。

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? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖1. 分離神經元中jGCaMP7的突變與篩選
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖2. jGCaMP7的篩選及體外特性研究
? ? ? ? 通過優化鈣離子探針的 Ca2+親和力同時進一步提高探針的靈敏度、信噪比、半衰期和動態范圍，研發出了jGCaMP7系列。追蹤神經元亞細胞的動態對神經環路研究具有重要意義，而樹突、軸突等亞細胞結構小，jGCaMP6 靈敏度低，成像保真度不高，而 jGCaMP7s，jGCaMP7f，jGCaMP7b很大程度上提高了在不同鈣離子濃度下的靈敏度，jGCaMP7f 同時具有較快的反應速率，這對于神經元亞細胞的動態檢測非常重要。
? ? ? ?? 研究人員隨后在在體水平驗證了jGCaMP7。在檢測jGCaMP7在成年果蠅橢球體神經元的表現中，檢測對于閉環視覺刺激下的運動果蠅的樹突神經活動，通過雙光子成像發現jGCaMP7f相比GCaMP6f表現出更高的檢測靈敏度(圖3)。通過對小鼠初級視覺皮層雙光子成像中，發現jGCaMP7b相比于GCaMP6s能夠在更多的樹突棘中檢測到對視覺刺激的反應(圖4)。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?圖3. jGCaMP7在成年果蠅橢球體神經元中的表現

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖4. 樹突棘中鈣信號的檢測

? ? ? ?目前 jGCaMP7已經被廣泛用于線蟲、果蠅、斑馬魚、小鼠等多個模式生物的研究。未來GCaMP的改進可能需要最大限度地增加其熒光強度，這將需要對GCaMP骨架進行重大改變，例如用更明亮的熒光蛋白取代cpGFP，用cpGFP發色團重新設計CaM-M13接口，或者使用完全不同的熒光基團。

二、樞密科技jGCaMP7系列鈣離子探針列表：