產(chǎn)品說(shuō)明
唾液酸是N或O取代的含九碳的酸性糖衍生物的總稱。這類糖中最常見(jiàn)的一種是N-乙酰神經(jīng)氨酸(NANA)。唾液酸廣泛分布在哺乳動(dòng)物的組織和體液包括血清之中。唾液酸寡糖具有抗病毒的能力，它還能夠影響血液的凝固和膽固醇水平。在體液中唾液酸濃度也是診斷癌癥的重要指標(biāo)。簡(jiǎn)單、直接的唾液酸含量檢測(cè)手段是最為理想的。本公司生產(chǎn)的唾液酸測(cè)試法采用了改進(jìn)的沃倫方法，即唾液酸被氧化成酰基丙酮酸，再與巴比妥酸反應(yīng)生成粉紅色產(chǎn)物。其顏色強(qiáng)度(549?nm)?或熒光強(qiáng)度(lem/ex?=?585/555?nm）與樣品中的唾液酸濃度成正比。
產(chǎn)品特點(diǎn)
靈敏、準(zhǔn)確：只需60mL?樣本，測(cè)試范圍：比色法5?~1000?mM，熒光法?0.5?~?100?mM。
產(chǎn)品用途
直接檢測(cè)血清、血漿、唾液、牛奶和生物制劑中唾液酸的含量。
試劑盒組成(96孔板供100?份檢測(cè))
顯色劑:??????6?mL?????? | 氧化試劑:?10?mL |
10%?TCA:?5?mL? | 水解試劑:?10?mL |
DMSO:????12?mL?? | 標(biāo)準(zhǔn)品:?500?mL?10?mM?唾液酸 |
儲(chǔ)存條件：室溫運(yùn)輸，標(biāo)準(zhǔn)品在-20°C下保存，其余試劑在室溫下保存。保質(zhì)期3個(gè)月。
預(yù)防措施：本產(chǎn)品僅供研究用。使用過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)安全措施。
96孔板比色法測(cè)試步驟
1.?標(biāo)準(zhǔn)：使用前，須將試劑放置至室溫。將25?mL?標(biāo)準(zhǔn)和?225?mL?蒸餾水混勻，配成1000mM唾液酸標(biāo)準(zhǔn)。按照下表比例，用蒸餾水稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
No | 標(biāo)準(zhǔn)品?+?dH2O | Vol?(mL) | 唾液酸(mM) |
1 | ?????100mL?+?????0mL | 100 | 1000 |
2 | ???????60mL?+???40mL | 100 | ??600 |
3 | ???????30mL?+???70mL | 100 | ??300 |
4 | ?????????0mL?+?100mL | 100 | ??????0 |
?
取4支做標(biāo)記好的Eppendorf試劑管，將20mL?標(biāo)準(zhǔn)分別加入到每個(gè)管中，再分別加入?5?mL?10%?TCA。
?2.?樣品處理：為測(cè)定唾液酸總含量(TSA)，需按如下方式將樣品水解：將20?mL?樣品,?40?mL?蒸餾水和?40?mL水解試劑在試劑管中混勻。在80°C下加熱?60分鐘，冷卻后加入25?mL?10%?TCA,?遙勻并離心10分鐘(14000?rpm)，取上清液?25?mL?加到試管中并標(biāo)記為?“TSA”。
????為測(cè)定游離的唾液酸含量(FSA),?直接將40mL?樣品和?10mL?10%?TCA混勻，離心10分鐘(14000?rpm)，取上清液?25?mL?加到試管中并標(biāo)記為?“FSA”。
3.?氧化：按如下比例為每個(gè)試管配備工作試劑：將15?mL水解試劑、50?mL?蒸餾水和?65?mL?氧化試劑混勻。在每個(gè)試管中分別加入125?mL?工作試劑，在室溫下靜置?60?分鐘。
4.?顯色反應(yīng)：在每個(gè)試管中加入?50?mL?顯色劑，混勻并在100°C
加熱10分鐘。冷卻?5-10?分鐘后，再在每個(gè)試管中加入?100mL?DMSO。混勻后以14,000?rpm的速度離心5分鐘。取透明平底96孔板，將?250?mL?上清液加到不同孔中。
5.?在549?nm?(540-555nm)處讀取吸光度。
96孔板熒光法測(cè)試步驟
熒光法比比色法敏感十倍。用蒸餾水配備?0,?30,?60?和100?mM?唾液酸標(biāo)準(zhǔn)?。
熒光法和比色法步驟基本相同，但熒光法中，將最終反應(yīng)的混合物加入黑色平底96孔板。在lex?=?555?nm?和?lem?=?585?nm處讀取熒光強(qiáng)度。
濃度計(jì)算
用標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度或熒光強(qiáng)度值減去空白值(4號(hào))，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品濃度作圖并得出斜率。樣本的唾液酸濃度計(jì)算如下：
R樣品和R對(duì)照?分別是樣品和蒸餾水對(duì)照(4號(hào))的吸光度或熒光強(qiáng)度值。n是樣品的稀釋系數(shù)，TSA?測(cè)試中?n?=?5?，FSA?測(cè)試中?n?=?1?。
注:?若計(jì)算出樣本的唾液酸濃度高于測(cè)試范值，需用水稀釋樣本并重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果需乘稀釋系數(shù)(n)。
單位換算：?1000?mM?NANA相當(dāng)于30.9?mg/dL或309?ppm。
實(shí)驗(yàn)必需品(未提供)
吸液用儀器，離心管，離心分離機(jī)，透明平底96孔板，加熱塊，黑色96孔板，吸光率閱讀器。
