基因克隆
產(chǎn)品名稱： 基因克隆
英文名稱： gene cloning
產(chǎn)品編號(hào)：
產(chǎn)品價(jià)格： 2000
產(chǎn)品產(chǎn)地： null
品牌商標(biāo)： null
更新時(shí)間： null
使用范圍： null
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人Oct-4啟動(dòng)子報(bào)告基因載體構(gòu)建
摘要： 以人基因組為模板擴(kuò)增Oct-4??啟動(dòng)子序列并構(gòu)建入pGL3-basic載體螢光素酶報(bào)告基因上游。根據(jù)螢光素酶的表達(dá)水平檢測(cè)Oct-4啟動(dòng)
子轉(zhuǎn)錄活性。
關(guān)鍵詞：Oct-4，啟動(dòng)子， 轉(zhuǎn)錄活性， luciferase， 報(bào)告基因
一、?實(shí)驗(yàn)原理
PCR擴(kuò)增Oct-4啟動(dòng)子序列， 構(gòu)建于pGL3-basic載體luciferase上游。根據(jù)螢光素酶的表達(dá)水平檢測(cè)Oct-4啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。
pGL3-basic載體圖譜如下：
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二、?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
構(gòu)建用于檢測(cè)Oct-4啟動(dòng)子活性的質(zhì)粒載體。
三、?實(shí)驗(yàn)方法
以人基因組DNA為模板擴(kuò)增Oct-4啟動(dòng)子序列，與經(jīng)Mlu I和Xho I酶切后的pGL3-basic載體片段同源重組后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，篩選到的陽(yáng)性克隆送測(cè)序。測(cè)序無(wú)誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1.?引物設(shè)計(jì)：
從GenBank中查詢目的基因上下游的序列，用Vector NTI軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。
PCR擴(kuò)增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系和條件如下：
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2.?瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果：
目的片段PCR擴(kuò)增成功后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，通過(guò)和DNA Marker的對(duì)比，判斷目的片段是否擴(kuò)增成功。
3.?膠回收目的片段：
把目的片段條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來(lái)，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。
4.?線性化表達(dá)載體的制備：
用限制性內(nèi)切酶對(duì)含報(bào)告基因載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2μg， 10 x反應(yīng)Buffer 5μl，限制性內(nèi)切酶各1μl，去離子水補(bǔ)足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來(lái)，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的片段同源重組到線性化報(bào)告基因載體載體中：
將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到離心管中進(jìn)行重組反應(yīng)：
混勻后在42℃孵育30min，然后轉(zhuǎn)移到冰上。放置2-3min后取10μl反應(yīng)液體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。
6.?感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化：
DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化，詳見(jiàn)《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子：
挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和PCR循環(huán)條件如下：
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8.?陽(yáng)性克隆送測(cè)序：
菌落鑒定得到的陽(yáng)性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果并分析。
9.?質(zhì)粒小提：
經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆，安排質(zhì)粒小提。具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。
四、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.?PCR擴(kuò)增目的片段：
用正向引物GTTTATCGATACGCGTTTCCCATGTCAAGTAAGGG（引物說(shuō)明：含同源重組序列、Mlu I酶切位點(diǎn)，并含有目的基因5’端配對(duì)序列用于PCR擴(kuò)增目的基因），反向引物GAAGCTTGAGCTCGAGGGGAAGGAAGGCGCCC（引物說(shuō)明：含同源重組序列、Xho I酶切位點(diǎn)下劃線標(biāo)記的， 并含有目的基因3’端配對(duì)序列用于PCR擴(kuò)增目的基因） 對(duì)人基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增， 預(yù)期PCR產(chǎn)物大小為3948 bp，電泳結(jié)果如下：
??????????????????????????????????????????? 1? ?? 2
????????????????????????????????????????
1．?PCR產(chǎn)物
2．?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2.?報(bào)告基因載體的線性化：
用Mlu I和Xho I對(duì)報(bào)告基因載體進(jìn)行雙酶切，膠回收4801bp的載體片段，酶切圖譜如下：
????????????????????????????????????? ??? 1?? 2?? 3
????????????????????????????????? ?? 
1．?空質(zhì)粒
2．?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3．?經(jīng)Mlu I和Xho I雙酶切的pGL3-basic載體
3.?菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆：
用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，正向引物Oct-4-F：GCCTACCGTGGTATTAGATGTC位于目的基因序列中，反向引物L(fēng)uc-N-R：? CCTTATGCAGTTGCTCTCC位于螢光素酶基因的N端序列，陽(yáng)性克隆得到1324bp的片段。電泳結(jié)果如下：
???????????????????????? ?? 1?? ? 2??? ?3??? ?4???? 5??? ?6???? 7???? 8??? 9?? 10?? 11
?????????????????????? ?
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1．?陰性對(duì)照（ddH2O）
2．?陽(yáng)性對(duì)照（GAPDH）
3．?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.? 挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子
接種陽(yáng)性克隆，保種并分裝100μl送測(cè)序。測(cè)序沒(méi)有問(wèn)題的，再接種抽提質(zhì)粒。
4.?測(cè)序結(jié)果分析：
??
??????????????????? 陽(yáng)性克隆測(cè)序結(jié)果表明，和預(yù)期序列完全一致。
?
五、?參考文獻(xiàn)
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學(xué)軍等譯，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（第四版），科學(xué)出版社
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