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人Oct-4啟動子報告基因載體構建

摘要： 以人基因組為模板擴增Oct-4??啟動子序列并構建入pGL3-basic載體螢光素酶報告基因上游。根據螢光素酶的表達水平檢測Oct-4啟動
子轉錄活性。
關鍵詞：Oct-4，啟動子， 轉錄活性， luciferase， 報告基因

一、?實驗原理
PCR擴增Oct-4啟動子序列， 構建于pGL3-basic載體luciferase上游。根據螢光素酶的表達水平檢測Oct-4啟動子轉錄活性。
pGL3-basic載體圖譜如下：

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二、?實驗目的
構建用于檢測Oct-4啟動子活性的質粒載體。

三、?實驗方法
以人基因組DNA為模板擴增Oct-4啟動子序列，與經Mlu I和Xho I酶切后的pGL3-basic載體片段同源重組后轉化E.coli感受態細胞。用菌落PCR鑒定轉化子，篩選到的陽性克隆送測序。測序無誤的克隆進行質粒抽提。實驗步驟如下：

1.?引物設計：
從GenBank中查詢目的基因上下游的序列，用Vector NTI軟件進行引物設計。
PCR擴增目的片段：
使用高保真的PrimeSTAR酶擴增目的片段，反應體系和條件如下：

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2.?瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增結果：
目的片段PCR擴增成功后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，通過和DNA Marker的對比，判斷目的片段是否擴增成功。
3.?膠回收目的片段：
把目的片段條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?線性化表達載體的制備：
用限制性內切酶對含報告基因載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg， 10 x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
5.?目的片段同源重組到線性化報告基因載體載體中：
將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比2:1加到離心管中進行重組反應：

混勻后在42℃孵育30min，然后轉移到冰上。放置2-3min后取10μl反應液體轉化到感受態細胞中。
6.?感受態細胞的制備和轉化：
DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
7.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

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8.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
9.?質粒小提：
經測序驗證正確的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、?實驗結果
1.?PCR擴增目的片段：
用正向引物GTTTATCGATACGCGTTTCCCATGTCAAGTAAGGG（引物說明：含同源重組序列、Mlu I酶切位點，并含有目的基因5’端配對序列用于PCR擴增目的基因），反向引物GAAGCTTGAGCTCGAGGGGAAGGAAGGCGCCC（引物說明：含同源重組序列、Xho I酶切位點下劃線標記的， 并含有目的基因3’端配對序列用于PCR擴增目的基因） 對人基因組DNA進行擴增， 預期PCR產物大小為3948 bp，電泳結果如下：
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1．?PCR產物
2．?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2.?報告基因載體的線性化：
用Mlu I和Xho I對報告基因載體進行雙酶切，膠回收4801bp的載體片段，酶切圖譜如下：
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1．?空質粒
2．?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3．?經Mlu I和Xho I雙酶切的pGL3-basic載體
3.?菌落PCR鑒定陽性克?。?br /> 用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物Oct-4-F：GCCTACCGTGGTATTAGATGTC位于目的基因序列中，反向引物Luc-N-R：? CCTTATGCAGTTGCTCTCC位于螢光素酶基因的N端序列，陽性克隆得到1324bp的片段。電泳結果如下：
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1．?陰性對照（ddH2O）
2．?陽性對照（GAPDH）
3．?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
4-11.? 挑取的8個轉化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。測序沒有問題的，再接種抽提質粒。

4.?測序結果分析：

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??????????????????? 陽性克隆測序結果表明，和預期序列完全一致。

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五、?參考文獻
1.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社

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