谷胱甘肽(Glutathione)是一種由3個氨基酸殘基（甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸）組成的小肽，保護細胞免受活性氧如自由基和過氧化物引起的細胞損傷。谷胱甘肽在細胞中主要以還原性谷胱甘肽(reduced glutathione, GSH)和氧化型谷胱甘肽(oxidized glutathione disulfide, GSSG)兩種形式存在。

GSH是細胞中重要的抗氧化劑，能維持蛋白的還原狀態。在谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)催化的反應中，兩個GSH分子通過巰基脫氫形成二硫鍵而產生GSSG。此外，谷胱甘肽還原酶(GR)氧化β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(β-NADPH2)的同時會將GSSG轉變為GSH。在正常細胞中，GSH的含量超過谷胱甘肽總量的90%；當細胞中氧化應激水平上升時，GSSG含量增加，GSH/GSSG比例下降，所以，GSH/GSSG比例可做為細胞中氧化應激水平的指標。

該試劑盒采用了一種特殊的非熒光染料，通過與GSH反應發出強烈熒光(Ex/Em=490/520 nm)，可定量分析樣品中的GSH含量；也可通過GSSG Probe將GSSG還原成GSH，定量分析樣品中的GSSG含量。該試劑盒靈敏度高，可以在100 µL測定體積中檢測到少至1 pM的GSH或GSSG。

產品組分

【注】：50120-E組分（GSSG Probe）配置后須在2 h以內使用完畢。

注意事項

1. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
3. 粉末溶解前請先短暫離心，以保證產品全在管底。
4. 請勿吸入、吞咽或者直接接觸皮膚和眼睛。
5. 本產品僅用于科研用途。

實驗過程

1 試劑準備

① GSH標準品母液(1 mM)：將200 μL Assay Buffer（B組分）加入GSH Standard（C組分）中制備1 mM GSH標準品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復凍融。

_{② GSSG標準品母液(1 mM)：將200 μL ddH2O加入GSSG Standard（F組分）中制備1 mM GSSG標準品母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C保存，避免反復凍融。}

③ Thiolite Green母液(100×)：將100 μL DMSO（D組分）逐滴加入Thiolite Green（A組分）中，渦旋振蕩混勻，制備100×Thiolite Green母液，用時置于冰上，未用完的分裝-20°C避光保存，避免反復凍融。

【注】：為充分溶解也可用200 μL DMSO配置成50×Thiolite Green母液。

④ GSH工作液：向100 μL Thiolite Green母液(100×)中加入10 mL Assay Buffer（B組分），混勻。

【注】：相當于兩個96孔板的檢測用量，請根據實際情況進行調整。GSH工作液在室溫下不穩定，注意避光，并在配置后2 h以內使用。

⑤ Total GSH工作液：將5 mL的GSH工作液加入到GSSG Probe（E組分），渦旋振蕩混勻。

【注】：相當于1個96孔板的檢測用量，請根據實際情況進行調整。Total Glutathione工作液在室溫下不穩定，注意避光，并在配置后2 h以內使用。

2 GSH和GSSG標準液準備

2.1 向10 μL的GSH標準母液(1 mM)中加入990 μL的Assay Buffer（B組分）配置10 μM GSH標準液；然后用Assay Buffer（B組分）按1：1比例依次稀釋200 μL的10 μM GSH標準液以制備5 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM、0.3125 μM和0.1563 μM的GSH標準液。

2.2 向10 μL的GSSG標準母液(1 mM)中加入990 μL的Assay Buffer（B組分）配置10 μM GSSG標準液；然后用Assay Buffer（B組分）按1：1比例依次稀釋200 μL的10 μM GSSG標準液以制備5 μM、2.5 μM、1.25 μM、0.625 μM、0.3125 μM、0.1563 μM和0.0781 μM的GSSG標準液。

【注】：稀釋的GSH和GSSG標準液不穩定，需要在配置后4 h以內使用。

3 樣本制備

^{3.1 細胞樣本：盡量使用新鮮樣本。收集104-105個細胞，預冷PBS潤洗后，加入100 μL裂解液(0.5% NP-40 in PBS, pH4-6)，冰上裂解，12,000g 4℃離心15 min取上清，去蛋白處理（見3.4）后用于檢測。}

3.2 組織樣本：取20 mg組織樣本，預冷PBS潤洗后，加入400 μL裂解液(0.5% NP-40 in PBS, pH4-6)，冰上勻漿，12,000g 4℃離心15 min取上清，去蛋白處理（見3.4）后用于檢測。

3.3 血漿、血清、血液和尿液樣本：使用新鮮樣本，去蛋白處理（見3.4）后，用于GSH/GSSG的測定。

_{3.4 樣本去蛋白處理：組織、細胞和生物液體中可能存在干擾檢測的蛋白酶類，可使用TCA/NaHCO3方法來去除蛋白。向樣本中加入5倍體積預冷的100% TCA，混勻后冰上孵育5-10 min，12,000g 4℃離心5 min取上清，然后逐滴加入NaHCO3溶液中和至pH為4-6，取1 μL樣品用pH試紙進行測定；13,000g 4℃離心15 min取上清用于GSH/GSSG的測定。}

【注】：避免中和后的溶液pH超過7，因為GSH不穩定，在pH>7時容易被氧化。

4 檢測GSH和Total GSH含量

4.1向黑色平底孔板中加入相應體積的標準液、待測樣本和空白對照（使用Assay buffer，組分B），見Table1；對于96孔板，每孔加入50 μL標準液或待測樣本，總測定體積為100 μL/孔；對于384孔板，每孔加入25 μL標準液或待測樣本，總測定體積為50 μL/孔。

Table 1. Layout of GSH standards, GSSG standards, Blank Control and test samples in a solid black 96-well microplate.

GSH = GSH Standard (GSH1 - GSH7, 0.1563 to 10 µM), GSSG = GSSG Standard (GSSG1 - GSSG7, 0.0781 to 5 µM), BL = Blank Control, TS = Test Sample

4.2 對于測定GSH含量(Panel A)，向GSH標準液、待測樣本和空白對照中加入同等體積GSH工作液。

4.3 對于測定Total GSH含量(Panel B)，向GSSG標準液、待測樣本和空白對照中加入等體積Total GSH工作液。

4.4 混勻后，室溫孵育10-60 min。

4.5 熒光酶標儀下測量熒光讀值，Ex/Em = 490/520 nm。

【注】：如果樣本熒光過高，注意稀釋樣本后再進行檢測。

數據分析

1 從空白標準孔獲得的讀數用作陰性對照。從其他標準的讀數中減去該值，以獲得基線校正值，熒光背景會隨時間而增加，因此標準品和測試樣本的熒光讀值計算前需減去空白孔的熒光強度值。然后，繪制標準讀數以獲得標準曲線和方程。該方程可以用于計算樣本中GSH和Total GSH含量。

圖1 GSH標準曲線

圖2 Total GSH標準曲線（橫坐標為GSSG標準液濃度(0.0781-2.5 µM)換算成相應GSH濃度）

2 通過Panel A GSH的標準曲線計算樣本中GSH的含量，注意樣本制備過程中的稀釋倍數。

3 通過Panel B GSSG的標準曲線計算樣本中Total GSH的含量，注意樣本制備過程中的稀釋倍數。

4 由于1 mole的GSSG能轉化成2 mole的GSH，GSSG= (Total GSH- GSH)/2。

冰袋運輸。避光保存于-20℃，有效期1年。