l??產品組成：

l?
產品簡介：

活性氧檢測試劑盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一種利用熒光探針DCFH-DA進行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細胞膜，從而使探針很容易被裝載到細胞內。細胞內的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細胞內活性氧的水平。

本試劑盒提供了活性氧陽性對照試劑Rosup，以便于活性氧的檢測。Rosup是一種混合物，濃度為50mg/mL。

本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。

本試劑盒可以測定100～500個樣品。

l??使用說明：

1.????????裝載探針

對于刺激時間較短（通常為2小時以內）的細胞，先裝載探針，后用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞。對于細胞刺激時間較長（通常為6小時以上）的細胞，先用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，后裝載探針。

原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養細胞。按照1∶1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。加入的體積以能充分蓋住細胞為宜，通常對于六孔板的一個孔加入稀釋好的DCFH-DA不少于1mL。37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?/span>20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

收集細胞后裝載探針：按照1∶1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度為10μmol/L。細胞收集后懸浮于稀釋好的DCFH-DA中，細胞濃度為一百萬至二千萬/mL，37℃細胞培養箱內孵育20分鐘。每隔3～5分鐘顛倒混勻一下，使探針和細胞充分接觸。用無血清細胞培養液洗滌細胞三次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。直接用活性氧陽性對照或自己感興趣的藥物刺激細胞，或把細胞等分成若干份后刺激細胞。通?；钚匝蹶栃詫φ赵诖碳ぜ毎?/span>20～30分鐘后可以顯著提高活性氧水平。

說明：僅在陽性對照孔中加入Rosup作為陽性對照，其余孔不必加入Rosup。

2.????????檢測

對于原位裝載探針的樣品可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察，或收集細胞后用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測。對于收集細胞后裝載探針的樣品可以用熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀檢測，也可以用激光共聚焦顯微鏡直接觀察。

3.????????參數設置

使用488nm激發波長，525nm發射波長，實時或逐時間點檢測刺激前后熒光的強弱。DCF的熒光光譜和FITC非常相似，可以用FITC的參數設置檢測DCF。DCF的激發光譜和發射光譜參考下圖。

4.????????其它說明

陽性對照可以按照1∶1000的比例使用。例如裝載好探針的細胞共1mL，可以加入1μL的陽性對照刺激。通常刺激后20-～30分鐘內可以觀察到非常顯著的活性氧水平升高。對于不同的細胞，活性氧陽性對照的效果可能有較大的差別。如果在刺激后30分鐘內觀察不到活性氧的升高，可以適當提高活性氧陽性對照的濃度。如果活性氧升高得過快，可以適當降低活性氧陽性對照的濃度。

另外，對于某些細胞，如果發現沒有刺激的陰性對照細胞熒光也比較強，可以按照1∶2000～1∶5000稀釋DCFH-DA，使裝載探針時DCFH-DA的濃度為2～5μmol/L。探針裝載的時間也可以根據情況在15～60分鐘內適當進行調整。

活性氧陽性對照（Rosup）僅僅用于作為陽性對照的樣品，并不是在每個樣品中都需加入活性氧陽性對照。

l??保存條件：

-20℃避光保存，有效期一年。

l??注意事項：

1.??????探針裝載后，一定要洗凈殘余的未進入細胞內的探針，否則會導致背景較高。

2.??????探針裝載完畢并洗凈殘余探針后，可以進行激發波長的掃描和發射波長的掃描，以確認探針的裝載情況是否良好。DCF的激發光譜和發射光譜請參考上圖。

3.??????盡量縮短探針裝載后到測定所用的時間（刺激時間除外），以減少各種可能的誤差。

4.??????為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。