技術服務---細胞毒性檢測服務

?MTT 可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成結晶狀的深紫色產物formazan，在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解，然后通過酶標儀可以測定490nm 波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快，則吸光度越高；細胞毒性越大，則吸光度越低。CCK-8 的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒?？捎糜谒幬锖Y選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏等試驗。

樣品要求：

培養瓶培養細胞，細胞匯合度需達到70%，灌滿新鮮培養基至接近瓶口處，封口膜纏緊封口。

細胞如在凍存管中需要足量干冰寄送。

服務項目及收費標準：

客戶提供：

細胞（常規細胞系可由我公司提供，需要收取一定費用）

處理細胞所需藥物

培養細胞需要如使用較為特殊培養基，也需要客戶提供

服務說明：

MTT:

1.收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，分于96孔板，每孔180μL，3000-10000個細胞/孔。

2.置37℃、5%CO2?溫箱培養使細胞貼壁，培養6-24小時。

3.加入適當濃度的受試化合物，繼續培養適當時間。

4.小心吸去上清，加入90μL?新鮮培養液，再加入10μL MTT?溶液，繼續培養4 h。

5.然后吸掉上清，每孔加入110μL Formazan?溶解液，置搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490 nm?處測量各孔的吸光值。

6.同時設置調零孔（培養基、MTT、Formazan?溶解液），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT、Formazan?溶解液），每組設定3復孔。

CCK-8:

一、制作標準曲線（測定細胞具體數量時）

1、先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。

2、按比例依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5?個細胞濃度梯度，每組3-6?個復孔。

3、接種后培養至細胞貼壁，然后加CCK-8?試劑培養一定時間后測定OD?值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X?軸），OD?值為縱坐標（Y?軸）的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（試用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8?后的培養時間。）

二、細胞活性檢測

1、在96?孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）。將培養板放在培養箱中預培養（在37℃,5% CO2?的條件下）。

2、向每孔加入10μL CCK-8?溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD?值的讀數）。

3、將培養板在培養箱內孵育1-4?小時。

4、用酶標儀測定在450nm?處的吸光度。

5、如果暫時不測定OD?值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M?的HCl?或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24?小時內吸光度不會發生變化。

三、細胞增殖-毒性檢測

1、在96?孔板中配置100?μL?的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24?小時（在37?℃，5% CO2?的條件下）。

2、向培養板加入10μL?不同濃度的待測物質。在培養箱孵育一段適當的時間（例如：6、12、24?或48?小時）。

3、向每孔加入10?μL CCK-8?溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD?值的讀數）。如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8?之前更換新鮮培養基（除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養基），去掉藥物影響。

4、將培養板在培養箱內孵育1-4?小時。

5、用酶標儀測定在450 nm?處的吸光度。

6、如果暫時不測定OD?值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10μL 0.1M?的HCl?或者1%SDS(W/V)溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24 小時內吸光度不會發生變化。