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結直腸癌（CRC）是世界范圍內第三大致死癌癥，由于其侵襲性強、預后差和缺乏靶向治療，因此發病率較高。基于5-氟尿嘧啶（5-FU）的化療在CRC的治療中起了重要作用。然而，由于長期使用5-FU會產生多藥耐藥性（MDR），從而嚴重削弱了治療效果[1, 2]。
?? 最近，科學家們發現癌癥耐藥株中miRNA在耐藥性方面起了重要作用，且藥物抗性的分子靶點和機制也被闡明[3, 4]，如miR-21可通過下調CRC中人類DNA MutS homolog2（hMSH2）誘導對5-FU的耐藥性[5]。文獻進一步報道，恢復失調的miRNAs可以有效克服耐藥性。因此，作者推測共傳遞MDR-reversing miRNA和化學治療藥物將是一種有望克服癌癥化療中MDR的有效方法。但是，安全有效的靶向給藥系統是CRC治療的關鍵。
?? 外泌體（exosomes）是由多泡體（MVB）與質膜融合時釋放到細胞外環境的一種膜泡[6]，在不同細胞的外泌體中都可以檢測到mRNAs、miRNAs和蛋白質的存在，以此挖掘外泌體介導細胞間通訊的潛在機制。文獻報道了外泌體可以有效地傳遞生物藥物，且通過分子途徑可以靶向識別腫瘤細胞，實現精準藥物遞送[7]。但是利用外泌體進行功能RNAs和化療藥物共遞送尚未被分析透徹，還需要進一步研究。
?? 近期東南大學肖忠黨課題組通過對外泌體進行改造，同時用外泌體共遞送5-FU和miR-21抑制劑（miR-21i）靶向結腸癌細胞，經體外和體內研究表明了用工程化外泌體遞送5-FU和miR-21i可有效逆轉耐藥性，并顯著增強了5-FU耐藥癌細胞的毒性[8]。

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實驗結果：
1.外泌體的分離和表征
?? 為了使外泌體具有靶向性，作者將Her2親合體與人Lamp2的胞外N端融合，根據以前的研究，Lamp2蛋白在外泌體膜中被大量發現。再將該融合結構克隆到帶有GFP的慢病毒載體中，形成了THLG，另外一種不含Her2親合體的融合結構，克隆后形成了LG，作為對照（Fig.1a）。隨后將THLG和LG轉染到HEK293T中，THLG-293T或LG-293T細胞的熒光顯微鏡圖片顯示，THLG和LG嵌合體蛋白存在于顆粒膜和質膜中（Fig.1b）。從THLG-293T或LG-293T的培養上清中分別超離出外泌體（THLG-EXO 和LG-EXO），再用western對外泌體的標志物如CD63、CD9、CD81進行檢測（Fig.1c）。為了驗證LAMP2融合蛋白是否結合到來自母細胞的外泌體中，作者用anti-GFP抗體和WB檢測了融合蛋白在母細胞和外泌體中的表達。如Fig.1c所示，融合蛋白（LG）的分子量大約在80kDa，而THLG融合蛋白略高于LG，這與糖基化LAMP2和GFP的分子大小之和一致。此外，結果顯示LG和THLG在HEK293T中均有高表達，并能整合到外泌體中。相比之下，在轉染GFP的HEK293T細胞的外泌體中沒有檢測到GFP的水平，說明細胞質中的GFP可能沒有整合到外泌體（Fig.1d）。此外，上述結果證明了含有GFP的融合蛋白存在于外泌體中，并對THLG-EXO和LG-EXO進行檢測，結果顯示可以在激光掃描共聚焦纖維鏡下觀察到GFP。這一結果進一步表明了融合蛋白成功地整合到外泌體中（Fig.1e）。
?? 然后利用透射電鏡（TEM）和動態激光散射光譜（DLS）對外泌體的形態和大小進行了評價。其中，THLG-EXO具有典型的碟狀雙層膜結構，直徑為60-130nm（Fig.1f）。DLS結果顯示外泌體的大小分布較窄，平均直徑為97nm，而THLG-EXO在裝載了5-Fu/miR-21i后大小為110nm（Fig.1g）。

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Fig.1 工程化外泌體的分離和分子特征

2.含miR?21i和5?FU外泌體的制備
?? 接下來，作者評估了THLG-EXO作為共遞送5-FU和miR?21i的載體的可行性。之前的一些結果表明，使用電穿孔可以有效地將化療藥物和外源短RNAs引入EVs。在本次研究中，作者也使用了電穿孔的方法將miR?21i和5?FU裝載入外泌體中。為了獲得最佳的電穿孔參數，作者測試了不同的電壓和脈沖長度對電穿孔效率的影響。結果表明，當時間常數為10ms，電壓為1000V時，裝載效率最高。電穿孔后，THLG-EXO/5-FU/miR-21i的體積在miR-21i和5-FU負載的外泌體的形態上顯示出一些細微的差異，包括略大的平均直徑（110±11.3nm）(Fig. 1f, g)和表面電位??? （11±2.7mV）。而TEM照片顯示THLG-EXO的平均直徑為97±6.2 nm，表面電位為?8±2.4 mV。關于這些變化，作者推測這是在外泌體中電穿孔miR-21i和5-FU的結果，因為所有用于產生外泌體的其他程序都是相同的。在最佳電穿孔條件下，HPLC和qRT-PCR結果表明，外泌體的5-FU和miR-21i負載量（LC）分別約為3.1%和0.5%。
3.THLG-EXO的體外靶向性
?? 為了分析THLG-EXO在體外的潛在靶向能力，作者建立了Her2陰性的SGC-7901 WT細胞和Her陽性的Her2-mcherry-SGC-7901細胞共培養模型并進行了評價(Fig. 2a)。熒光顯微鏡結果顯示，與SGC-7901 WT細胞相比，THLG-EXO與Her2-mcherry-SGC-7901細胞共培養3h后，THLG-EXO能更有效地進入Her2-mcherry-SGC-7901細胞。相比之下，LG-EXO在Her2-mcherry-SGC-7901細胞中沒有表現出這種特異性的定位，且在共培養模型中隨機分布(Fig. 2b)。此外，利用流式細胞儀定量分析了THLG-EXO的細胞攝取情況。圖Fig. 2c所示，與THLG-EXO共培養3h后，GFP陽性的Her2-mcherry-SGC-7901細胞增加了92.9%，而SGC-7901細胞則為18.6%，差異具有統計學意義（p<0.01）。相比之下，與LG-EXO共培養3h后，GFP陽性的Her2-mcherry-SGC-7901細胞百分比僅增長了1.4%，而SGC-7901細胞比例為1.2%。這些結果表明使用T-Her2作為Her2的配體可以顯著地增強外泌體靶向細胞的能力。

Fig.2THLG-EXO在體外的細胞趨向性

4.THLG?EXO/5?FU/miR?21i的體外抗腫瘤作用
?? 上述結果表明，工程化外泌體能有效地被受體細胞吸收。隨后，作者研究了包裹了miR-21i和5-FU的THLG?EXO誘導的生物學效應以及miR-21i和5-FU對5-FU耐藥的結腸癌細胞系的協同細胞毒性。HCT-116的5-FU耐藥株是在5-FU濃度逐漸增加的情況下，由這些細胞連續傳代產生的。首先，作者研究了THLG?EXO/5?FU/miR?21i傳遞寡核苷酸進入靶細胞的能力。如Fig.3a所示，HCT-116^5FR與THLG?EXO/miR?21i共孵育6h后，其內源性miR-21水平顯著降低，而與游離的miR?21i共孵育后并沒有出現這種情況，說明與游離的miR-21i共孵育后并沒有寡核苷酸進入HCT-116^5FR細胞。為了進一步證實THLG?EXO/5?FU/miR?21i中miR?21i在HCT-116^5FR細胞中誘導的生物學功能，作者評估了miR-21下游靶基因的表達水平，如hMSH2和PTEN。如所預期的，與THLG-EXO處理的細胞相比，HCT-1165FR細胞用THLG-EXO/5-FU/miR-21i處理后，hMSH2和PTEN的蛋白表達水平增加（Fig.3b）。這些結果表明THLG?EXO/5?FU/miR?21i可以有效地將miR-21i傳遞到受體細胞的細胞質中，且能特異性地沉默受體細胞中miR-21的生物學功能。
?? 接下來，為了評估THLG?EXO介導的5-FU和miR-21i共遞送的協同抗腫瘤效果，作者研究了5-FU濃度為5ug/ml時HCT-116^5FR細胞的凋亡、細胞周期和增殖情況。如Fig.3c所示，與裝載了miR-21i或5-FU的THLG?EXO共孵育后，HCT-116^5FR細胞的凋亡率分別達到12.6%和26.2%。顯然，與mock-THLG-EXO處理組相比，只遞送miR-21i并不能達到理想的治療效果。相比之下，THLG-EXO介導的5-FU和miR-21i共遞送引起的細胞凋亡率（凋亡率約42.3%）要高于THLG-EXO/5-FU處理的細胞組（凋亡率約26.2%），這說明了協同效果對靶細胞的凋亡影響最強。
?? 隨后，通過PI對細胞周期進行評估，結果顯示，與THLG?EXO相比，THLG?EXO/5?FU/miR?21i對HCT-1165FR細胞的S期阻斷顯著，而THLG?EXO/miR?21i對HCT-116^5FR細胞周期分布沒有明顯的影響（Fig.3d）。值得注意的是，與THLG?EXO相比，THLG?EXO/5?FU/miR?21i對HCT-1165FR細胞的G1期也有一定程度的影響，但是這種效果沒有對S期明顯。此外，作者還分析了THLG?EXO/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/5?FU/miR?21i抑制癌細胞增殖的能力。結果顯示，這三種外泌體都可以抑制細胞的增殖，但是隨時時間的推移，它們對細胞增殖的影響有明顯的差異。如Fig.3e所示，與THLG?EXO/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/5?FU/miR?21i共培養6天后，細胞增殖分別被抑制了約12%、43%和82%。這個結果表明，雖然THLG?EXO/5?FU具有較強的抑制生長的作用，但是THLG?EXO/5?FU/miR?21i對細胞增殖的抑制作用更強，幾乎完全抑制了細胞的增殖。而用THLG?EXO/miR?21i處理的細胞增殖略有下降。這與作者在細胞周期阻斷和凋亡結果上的發現一致。因此，研究結果揭示了miR?21i可以提高HCT-116^5FR細胞對5-FU的敏感性，并且與單藥劑治療相比，5-FU與miR-21i聯合治療可以顯著提高5-FU對HCT-116^5FR細胞的抗腫瘤作用。

Fig.3 用THLG?EXO/5?FU/miR?21i體外處理HCT-1165FR細胞的結果

5.THLG?EXO在體內的分布情況
?? THLG?EXO介導的miR?21i和5?FU對Her2陽性癌細胞的共遞送已顯示理想的體外遞送效果。隨后，作者用體內成像系統評估其體內遞送效率。為了闡述體內靶向腫瘤的能力，作者在BALB/c雌性裸鼠的皮下接種了HCT-1165FR細胞。之后，用DiR染料標記THLG?EXO和LG?EXO，經尾靜脈注射入裸鼠體內。在不同的時間點監測注射的外泌體的生物分布情況。如Fig.4所示，在注射后的最早時間點（30min），THLG?EXO和LG?EXO迅速分布全身，不同的是，THLG?EXO在腫瘤內分布比較多，說明THLG?EXO在腫瘤區域內能快速積累，而LG?EXO主要分布在肝臟，這表明了LG?EXO吸收和保留主要發生在肝臟和其他代謝器官，沒有在腫瘤區域積累。此外，隨著時間的推移，在這兩組之間發現了顯著的差異。在注射THLG?EXO 3小時后，腫瘤區域能檢測到較強的熒光信號，而小鼠身體其他部位的英冠光信號逐漸減弱。此外，在注射LG?EXO 6小時后，足部和頸部仍可檢測到相對強烈的熒光信號。相比之下，THLG?EXO組在這些部位沒有檢測到信號，而熒光信號僅在腫瘤部位檢測到了。綜上所述，這些數據表明THLG?EXO可以作為靶向Her2表達腫瘤細胞的有效藥物載體。

Fig.4 用HCT-1165FR細胞接種到裸鼠里觀察THLG?EXO的腫瘤靶向能力

6.THLG?EXO/5?FU/miR?21i的體內抗腫瘤作用
?? 體外實驗顯示THLG?EXO具有高效靶向腫瘤細胞給藥的能力，以及miRNA調控與5-FU治療的協同作用，隨后作者也在體內用這種多組合方法評估是否能增強抗腫瘤作用。作者將HCT-1165FR-Luc誘導的腫瘤雌性裸鼠隨機分成四組并給予注射藥物制劑，包括THLG?EXO/5?FU/miR?21i、THLG?EXO/5?FU、THLG?EXO/miR?21i及THLG?EXO對照組。作者用腫瘤部位的生物熒光強度估計腫瘤大小。與預期一樣，THLG-EXO/5-FU/miR-21i組效果最佳，即腫瘤體積隨時間顯著縮小。如Fig.5a所示，其他的治療仍有不同程度的腫瘤擴大，尤其是THLG-EXO組，惡性腫瘤轉移比較明顯。通過測量相對發光強度，定量各組小鼠的平均發光強度（BLI）（Fig.5b）。在研究結束時，處死小鼠，切除腫瘤并稱重。如Fig.5c所示，顯然，與注射THLG-EXO和THLG-EXO/5-FU的小鼠相比，注射THLG-EXO/5-FU/miR-21i的小鼠腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤重量下降。
?? 為了進一步評估不同外泌體在腫瘤中誘導的細胞凋亡情況，作者采用TdTdUTP標記（TUNEL）染色分析細胞凋亡。如Fig.5d所示，靜脈注射THLG-EXO/5-FU或THLG-EXO/5-FU/miR-21i后，TUNEL陽性細胞數量明顯增加，其中THLG-EXO/5-FU/miR-21i組尤為明顯。靜脈注射THLG-EXO/miR-21i后，TUNEL陽性細胞數略有增加，表明了僅使用miR-21i對細胞凋亡影響不大。然而，工程化外泌體同時結合miR-21i和5-FU可以得到非常顯著的抗腫瘤作用。隨后，作者通過WB檢測了外泌體傳遞的miR-21i的基因調控活性。如Fig.5e所示，THLG-EXO/miR-21i和THLG-EXO/5-FU/miR-21i能提升腫瘤組織中hMSH2和PTEN的蛋白表達，而THLG-EXO單獨遞送5-FU對hMSH2和PTEN的表達幾乎沒有明顯的影響。這些體內的實驗結果與細胞內的體外實驗結果呈正相關，并且發現THLG-EXO介導5-FU和miR-21i共遞送，對腫瘤的作用效果最好。

Fig.5 HCT-1165FR-Luc異種移植到裸鼠里研究THLG-EXO/5-FU/miR-21i抗腫瘤活性

7.體內的安全性評估
?? 除了治療效果，毒性是一個優良載體進一步使用需要考慮的另一個關鍵參數。出于安全考慮，作者每隔一天靜脈注射20mg/kg 劑量的THLG-EXO，持續一周后評估THLG-EXO是否對健康BALB/c小鼠的全身系統產生毒性。與PBS組相比，實驗組在研究期間沒有觀察到小鼠的死亡和嚴重的體重下降（數據未顯示）。眾所周知，經靜脈注射的納米級脂泡大部分被單核吞噬細胞系統（MPS）吸收和清除。因此，作者進一步研究了外泌體對這些器官誘發的潛在病理損傷。用血液生化和血液學分析外泌體對處理小鼠的任何潛在毒性作用。作者檢測了不同生化指標，包括肝功能指標如谷丙轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST），腎功能指標如肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）。從表1中可以看出，上述各項指標均與PBS處理組相同，說明THLG-EXO在給藥方案中沒有明顯的肝或腎毒性。血液學檢查包括白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）和血小板計數。上述參數中THLG-EXO處理組與PBS組比較均無顯著性差異（Table 1）。此外，如Fig.6所示，在THLG-EXO處理組中心臟、肝臟、脾臟、肺、腎等主要組織未見明顯的組織病理學異?；虿∽?，這說明了THLG-EXO沒有引起炎癥反應。這些結果表明，THLG-EXO多次給藥對小鼠血液系統和主要器官不會引起急性毒性。

Table 1 THLG-EXO處理組小鼠的臨床化學和血液學參數
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Fig.6 THLG-EXO的系統毒性評價

結論：
?? 在本篇研究中，作者成功開發了一種聯合策略，利用工程化外泌體的傳遞系統，同時將miR-21i和化療藥物5-FU傳遞給HCT-1165FR癌細胞，有效逆轉了耐藥性，提高了腫瘤治療的作用。
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