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hsa-mir-21 TuD RNA封閉載體構建

摘要：設計針對hsa-mir-21的TuD RNA封閉片段。通過分子生物學手段將該封閉片段構建入腺病毒載體（pAdeno-RNAi-U6-CMV-EGFP）的U6啟動子下游，該載體可以實現在封閉hsa-mir-21的同時表達綠色熒光蛋白EGFP，便于觀察載體工作狀態。除了可以直接瞬時轉染細胞用于hsa-mir-21的封閉，該載體也可以包裝腺病毒， 用于動物水平封閉hsa-mir-21。
關鍵詞：TuD RNA，hsa-mir-21封閉， adenovirus vector， EGFP

一、 實驗原理

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????????????????????????????????????????????????????????????????????????????TuD RNA 原理示意圖

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如圖所示，TuD RNA（Tough Decoy RNA）是一個包含兩個miRNA互補序列（MBS）的序列。該序列在轉錄之后會形成如圖所示的相對穩定的莖環狀結構，并被轉運到細胞質中。通過與目標miRNA互補的序列來封閉目標miRNA的功能。表達載體pAdeno-U6-CMV-EGFP圖譜如下：

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二、?實驗目的
構建帶有EGFP熒光標記的hsa-mir-21封閉（TuD RNA）腺病毒載體。

三、?實驗方法
TuD RNA-hsa-mir-21為封閉hsa-mir-21序列，以化學合成的TuD RNA-hsa-mir-21基因通過雙酶切得到目的基因片段。表達載體酶切后回收線性化的載體片段。目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉化E.coli感受態細胞。用菌落PCR鑒定轉化子，陽性克隆送測序。測序無誤的克隆進行質粒抽提。實驗步驟如下：

1.?TuD RNA的化學合成：
從miRBase中查詢到hsa-mir-21的序列，并設計其TuD RNA序列，上下游酶切位點分別為Age I和EcoR I，安排化學合成。
2.?制備線性化TuD RNA表達載體：
用限制性內切酶對表達載體進行酶切，酶切反應體系為：質粒2μg，10 x反應Buffer 5μl，限制性內切酶各1μl，去離子水補足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產物進行進行瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
3.?膠回收目的基因片段：
把化學合成的TuD RNA進行酶切得到目的基因片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?目的基因連接入表達載體：
???????????????????????????????????????? 將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比3:1加到離心管中：?
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????????于16℃ 連接過夜，第二天取10μl反應液體轉化到100μl感受態細胞中。

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5.?感受態細胞的制備和轉化：
DH5α感受態細胞的制備和轉化，詳見《精編分子生物學實驗指南》。
6.?菌落PCR鑒定陽性轉化子：
挑取平板上長出的轉化子重懸于10μl LB培養液中，取1μl做模板進行菌落PCR鑒定。反應體系和PCR循環條件如下：

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7.?陽性克隆送測序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送測序公司進行測序驗證。軟件比對測序結果并分析。
8.?質粒小提：
測序通過的陽性克隆，安排質粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。

四、?實驗結果
1.?酶切獲得目的基因片段：
用 Age I和EcoR I對化學合成的目的基因進行酶切，膠回收135bp的目的基因片段。酶切圖譜如下：

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1.?用 Age I和EcoR I對化學合成的pTuD-NC 進行酶切
2.?用 Age I和EcoR I對化學合成的TuD RNA-hsa-mir-21 進行酶切
3.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

2.?表達載體的線性化：
用Age I和EcoR I對表達載體進行雙酶切，膠回收5.1kb的載體片段，酶切圖譜如下：

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1.?線性化表達載體
2.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp

3.?菌落PCR鑒定陽性克?。?br /> 用菌落PCR鑒定轉化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6啟動子序列中，反向引物pY-SEQR： CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV啟動子的5’序列，陽性克隆得到415bp的片段，空載體得到282bp的片段。電泳結果如下：
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1.?陰性對照（空載體）
2.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
3-10 挑取的8個轉化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測序。經驗證序列無誤的，抽提質粒。

4.?測序結果分析
TuD RNA-hsa-mir-21為封閉hsa-mir-21（hsa-mir-21，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA）序列，其測序結果如下：
GATAAAAATACTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCACTACGCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACGCAGCTGCCGTGCCCTGACCACCCTCGTGACACCTGACTACGGGTGCATGCTTCAGCCGCTACCGGACAATGAGCACACGACCTCTTCAGTTCGCATGCCGAGGCTACGTCAGGGGCCACCATCTTCTTTCAGGAGACGACGGGGCAACTATCTAGAAA
陽性克隆測序結果表明，和預期的序列完全一致，證實該封閉載體構建成功。

五、?參考文獻
1.?Haraguchi T, Ozaki Y, Iba H.Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009;6-43.
2.?F.M.奧斯伯等著，馬學軍等譯，精編分子生物學實驗指南（第四版），科學出版社

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