封閉miRNA構(gòu)建
產(chǎn)品名稱： 封閉miRNA構(gòu)建
英文名稱： TuD RNA expression vector construction
產(chǎn)品編號(hào)：
產(chǎn)品價(jià)格： 1800
產(chǎn)品產(chǎn)地： null
品牌商標(biāo)： null
更新時(shí)間： null
使用范圍： null
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hsa-mir-21 TuD RNA封閉載體構(gòu)建
摘要：設(shè)計(jì)針對(duì)hsa-mir-21的TuD RNA封閉片段。通過分子生物學(xué)手段將該封閉片段構(gòu)建入腺病毒載體（pAdeno-RNAi-U6-CMV-EGFP）的U6啟動(dòng)子下游，該載體可以實(shí)現(xiàn)在封閉hsa-mir-21的同時(shí)表達(dá)綠色熒光蛋白EGFP，便于觀察載體工作狀態(tài)。除了可以直接瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于hsa-mir-21的封閉，該載體也可以包裝腺病毒， 用于動(dòng)物水平封閉hsa-mir-21。
關(guān)鍵詞：TuD RNA，hsa-mir-21封閉， adenovirus vector， EGFP
一、 實(shí)驗(yàn)原理
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????????????????????????????????????????????????????????????????????????????TuD RNA 原理示意圖
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如圖所示，TuD RNA（Tough Decoy RNA）是一個(gè)包含兩個(gè)miRNA互補(bǔ)序列（MBS）的序列。該序列在轉(zhuǎn)錄之后會(huì)形成如圖所示的相對(duì)穩(wěn)定的莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中。通過與目標(biāo)miRNA互補(bǔ)的序列來封閉目標(biāo)miRNA的功能。表達(dá)載體pAdeno-U6-CMV-EGFP圖譜如下：
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二、?實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
構(gòu)建帶有EGFP熒光標(biāo)記的hsa-mir-21封閉（TuD RNA）腺病毒載體。
三、?實(shí)驗(yàn)方法
TuD RNA-hsa-mir-21為封閉hsa-mir-21序列，以化學(xué)合成的TuD RNA-hsa-mir-21基因通過雙酶切得到目的基因片段。表達(dá)載體酶切后回收線性化的載體片段。目的基因片段與線性化的載體片段連接后轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)細(xì)胞。用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，陽性克隆送測(cè)序。測(cè)序無誤的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提。實(shí)驗(yàn)步驟如下：
1.?TuD RNA的化學(xué)合成：
從miRBase中查詢到hsa-mir-21的序列，并設(shè)計(jì)其TuD RNA序列，上下游酶切位點(diǎn)分別為Age I和EcoR I，安排化學(xué)合成。
2.?制備線性化TuD RNA表達(dá)載體：
用限制性內(nèi)切酶對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為：質(zhì)粒2μg，10 x反應(yīng)Buffer 5μl，限制性內(nèi)切酶各1μl，去離子水補(bǔ)足50μl，于37℃水浴鍋中孵育2h以上。酶切產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果，并把目的載體條帶從瓊脂糖凝膠電泳后的膠中割下來，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收。
3.?膠回收目的基因片段：
把化學(xué)合成的TuD RNA進(jìn)行酶切得到目的基因片段，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做膠回收，具體步驟參考試劑盒說明書。
4.?目的基因連接入表達(dá)載體：
???????????????????????????????????????? 將目的DNA片段和線性化載體以摩爾比3:1加到離心管中：?
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????????于16℃ 連接過夜，第二天取10μl反應(yīng)液體轉(zhuǎn)化到100μl感受態(tài)細(xì)胞中。
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5.?感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化：
DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化，詳見《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。
6.?菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子：
挑取平板上長(zhǎng)出的轉(zhuǎn)化子重懸于10μl LB培養(yǎng)液中，取1μl做模板進(jìn)行菌落PCR鑒定。反應(yīng)體系和PCR循環(huán)條件如下：
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7.?陽性克隆送測(cè)序：
菌落鑒定得到的陽性克隆，送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。軟件比對(duì)測(cè)序結(jié)果并分析。
8.?質(zhì)粒小提：
測(cè)序通過的陽性克隆，安排質(zhì)粒小提。具體步驟見試劑盒說明書。
四、?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1.?酶切獲得目的基因片段：
用 Age I和EcoR I對(duì)化學(xué)合成的目的基因進(jìn)行酶切，膠回收135bp的目的基因片段。酶切圖譜如下：
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1.?用 Age I和EcoR I對(duì)化學(xué)合成的pTuD-NC 進(jìn)行酶切
2.?用 Age I和EcoR I對(duì)化學(xué)合成的TuD RNA-hsa-mir-21 進(jìn)行酶切
3.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
2.?表達(dá)載體的線性化：
用Age I和EcoR I對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，膠回收5.1kb的載體片段，酶切圖譜如下：
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1.?線性化表達(dá)載體
2.?1kb DNA ladder Marker：10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3.?菌落PCR鑒定陽性克隆：
用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG 位于人U6啟動(dòng)子序列中，反向引物pY-SEQR： CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV啟動(dòng)子的5’序列，陽性克隆得到415bp的片段，空載體得到282bp的片段。電泳結(jié)果如下：
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1.?陰性對(duì)照（空載體）
2.?DL2,000 DNA? Marker： 2 kb， 1 kb，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp
3-10 挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子
接種陽性克隆，保種并分裝100μl送測(cè)序。經(jīng)驗(yàn)證序列無誤的，抽提質(zhì)粒。
4.?測(cè)序結(jié)果分析
TuD RNA-hsa-mir-21為封閉hsa-mir-21（hsa-mir-21，UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA）序列，其測(cè)序結(jié)果如下：
GATAAAAATACTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTGGCGCTAGGATCATCAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGTATTCTGGTCACAGAATACAACTCAACATCAGTCATCTTGATAAGCTACAAGATGATCCTAGCGCCACCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCACTACGCAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACGCAGCTGCCGTGCCCTGACCACCCTCGTGACACCTGACTACGGGTGCATGCTTCAGCCGCTACCGGACAATGAGCACACGACCTCTTCAGTTCGCATGCCGAGGCTACGTCAGGGGCCACCATCTTCTTTCAGGAGACGACGGGGCAACTATCTAGAAA
陽性克隆測(cè)序結(jié)果表明，和預(yù)期的序列完全一致，證實(shí)該封閉載體構(gòu)建成功。
五、?參考文獻(xiàn)
1.?Haraguchi T, Ozaki Y, Iba H.Vectors expressing efficient RNA decoys achieve the long-term suppression of specific microRNA activity in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 2009;6-43.
2.?F.M.奧斯伯等著，馬學(xué)軍等譯，精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南（第四版），科學(xué)出版社
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