神經元逆向跨多標記

簡介
大腦神經網絡是由數目龐大，以及形態、功能各異的神經元，通過突觸連接構成的復雜結構，是大腦行使認知、情感、記憶及想象等活動的結構基礎。提示大腦神經網絡的結構是理解大腦處理信息的機制的前提，傳統的示蹤方法促進了人們對大腦神經網絡結構的認識，但難以用于研究多個腦區、多種類型神經元通過突觸連接形成復雜的神經網絡，這類神經網絡才是大腦處理特定信息所依賴的環路。
解析大腦不同腦區、不同類型神經元之間的神經環路連接是神經科學研究的重要任務之一，繪制大腦連接體圖對于理解大腦如何工作是至關重要的，病毒工具是目前最為有效、應用最廣的神經環路示蹤工具。神經回路是神經功能的基本單位，是連接大尺度（結構/功能）和小尺度（分子/信號通路）的橋梁，有效地繪制神經回路需要逆行和順行示蹤病毒同時傳輸多級或單級突觸。目前，PRV是常用的逆向跨多級病毒載體工具。

圖1. ?神經元逆向跨多級標記示意圖

病毒策略
PRV
野生PRV的分離株（Becker株）毒性較大，在神經環路傳播過程中，既可以順突觸傳播，又可以逆突觸傳播。而PRV的疫苗株（Bartha株）毒性較低，基于PRV Bartha株構建的重組示蹤工具病毒，能夠嚴格逆向跨多突觸標記神經網絡。病毒感染神經細胞后，在胞內復制并表達目的基因，子代病毒運輸到突觸后，逆向跨突觸進入上游神經元，開始新一輪的復制及逆向跨突觸傳播等過程。

圖2.?PRV Bartha株逆向跨多突觸標記
PRV-hUbC-EGFP注射嗅結節（TU）48小時后，逆向跨多突觸標記上游腦區，包括M1，M2，Aco，Piri，OB，VTA等區域，表明這些腦區對TU有直接或間接的投射。

圖3. 向腦區TU注射PRV ，可標記該注射區域不同級數的輸入神經網絡（BrainVTA）

案列展示
實例一：DS的逆向跨多級病毒示蹤
實驗動物：C57BL/6J?mice
使用的病毒：PRV152-GFP?
實驗方法和結果：將PRV152-GFP注射到小鼠雙側背側紋狀體（DS），觀察到PRV152-GFP逆行跨多級到了R-NG、DMV、NTS、AP、PBNdl和PBNm，根據先前的結果進一步驗證了R-NG → PBNdl→ SNc通路的存在。

圖4. R-NG → PBNdl→ SNc通路的驗證（Han W, et al., Cell, 2018）

實例二：膀胱壁神經的逆向跨多級病毒示蹤
實驗動物：C57BL/6J mice ?
使用的病毒：PRV-EGFP、PRV-RFP ?
實驗方法和結果：將PRV-EGFP注射到小鼠膀胱壁后，在皮層S1/M1 L5錐體神經元觀察到EGFP信號。分別將PRV-EGFP與PRV-RFP注射到小鼠右側和左側膀胱壁，在皮層S1/M1 L5錐體神經元觀察到EGFP和RFP共同表達。表明PRV-EGFP、PRV-RFP無差別逆行跨多級到皮層S1/M1 L5錐體神經元，皮層S1/M1 L5錐體神經元為支配膀胱壁的上游腦神經元群。

圖5. 膀胱上游皮層M1 L5錐體神經元群的鑒定（Yao J,?et al., Nat Neurosc, 2018）

可用于研究的神經科學問題：

1. 研究大腦特定區域的全腦范圍多級輸入網絡結構。逆行追蹤感知覺系統信息從外周向中樞的輸入網絡，從低級腦區向高級腦區的信息輸出的網絡結構；從高級腦區向低級腦區反饋信息輸出的網絡結構；
2. 神經發育過程中的神經網絡變化；
3. 神經精神疾病模型中，大腦中樞及外周信息輸出神經網絡結構特征和異常變化；
4. 神經損傷及康復模型中，大腦中樞及外周信息輸出神經網絡的連接狀況的損傷程度和恢復程度；
5. 追蹤外周器官與中樞神經系統間的聯系通路。

1. Ekstrand MI, Enquist LW, Pomeranz LE.?The alpha-herpesviruses: molecular?pathfinders in nervous system circuits. Trends in molecular medicine.?2008; 14:134-140.
2. Han W,?Tellez LA,?Perkins MH,?Perez IO,?Qu T,?Ferreira J,?Ferreira TL,?Quinn D,?Liu ZW,?Gao XB,?Kaelberer MM,?Bohórquez DV,?Shammah-Lagnado SJ,?de Lartigue G,?de Araujo IE. A?Neural?Circuit?for?Gut-Induced??Reward.?Cell.?2018;?175(3):887-888.?
3. Yao J,?Zhang Q,?Liao X,?Li Q,?Liang S,?Li X,?Zhang Y,?Li X,?Wang H,?Qin H,?Wang M,?Li J,?Zhang J,?He W,?Zhang W,?Li T,?Xu F,?Gong H,?Jia H,?Xu X,?Yan J,?TUNEology 波長可調檢測卡盒-->