凋亡檢測操作流程
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一、Annexin V?檢測凋亡細胞膜的改變
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試劑及溶液：
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A．對于單獨購買的試劑：
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a) 10X Binding Buffer （貨號：556454）：0.1 M HEPES，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2。使用前稀
釋至 1X。
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b) Propidium Iodide（PI，貨號：556463）：建議與以下試劑同時使用 Annexin V-FITC（貨號： 556420,
556419）或 Annexin V-Biotin （貨號： 556418，556417）
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c) Via-Probe? （貨號：555816 ）：核酸染料 7-AAD。建議與以下試劑同時使用 Annexin V-PE（貨號：
556422，556421）或 Annexin V-Biotin（貨號：556418，556417）。
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d) 1X PBS Buffer （貨號： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 · 7H20, 0.24 g KH2PO4 , 加水至
1L。調整 pH 值至 7.2。 高壓滅菌室溫保存。
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B．對于凋亡檢測試劑盒（貨號：556547）
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a)? FITC Annexin V （組分編號： 51-65874X）：每個樣本 5 μl 用量。
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b)? Propidium Iodide （PI，組分編號： 51-66211E)）：現成的核酸染料。每個樣本 5 μl 用量。
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c)? 10X Annexin V Binding Buffer（組分編號： 51-66121E）： 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl,
25 mM CaCl2.使用時用雙蒸水配制成 1X。
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操作步驟：
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1．取 Falcon 試管，按標本順序編好陰性對照管和標本管號。
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2．使用冷的 PBS 緩沖液洗細胞兩次，再用 1′ Binding Buffer 緩沖液制成 1′106 細胞/ml 的懸液。
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3． Falcon 試管中加入 100 μl 細胞懸液。
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4．按以下體積加入 Annexin V 與核酸染料：
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管號????????? 名稱??????????? 熒光標記 Annexin V??????????? 核酸染料：
1 ? ? ? ? ? 陰性對照????????? ???????-???????????????????????? -
2 ? ? ? ? ? ?單陽 1?????????????? AV-FITC ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?-

3 ? ? ? ? ? ?單陽 2 ? ? ? ? ? ? ? ? ?- ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? PI
4 ? ? ? ? ? ?樣本 ? ? ? ? ? ? ? ? AV-FITC????????????????????? PI

5．輕輕混勻，室溫（20°C ~25°C）避光處放置 15 分鐘。
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6． *使用 Annexin V-Biotin 試劑進行檢測時：
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h? 1′Binding Buffer緩沖液洗細胞一次，去上清。
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h? 1′Binding Buffer緩沖液100μl溶解SAv-FITC試劑0.5μg，加入到細胞管中。
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h 輕輕混勻。加入5μl PI，室溫（20-25°C）避光處放置15分鐘。
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7．各試驗管中分別加入 1′Binding Buffer 緩沖液 400μl。1 小時內上流式細胞儀測定結果。

Annexin V Blocking?
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待測細胞與未標記的重組 Annexin V 預孵育，然后進行實驗，是 Annexin V 細胞凋亡檢測的質量控制。
原理是預先阻斷 Annexin V-FITC 的結合位點，這樣可以證明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特異性。
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1.? 使用冷的PBS緩沖液洗細胞兩次，再用1′Binding Buffer緩沖液制成1′106細胞/ml的懸液。
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2.? 在5ml的培養管中加入100μl細胞懸液（約1′105個細胞）。
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3.? 加入5-15μg純化的重組Annexin V。注意，不同的細胞系，以及凋亡的不同階段，其Annexin V位點
飽和所需要的純化的重組Annexin V含量不同。某些情況下，為達到最好效果，可以減少細胞數量，
0.5′105個細胞加5-15μg純化的重組Annexin V。
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4.? 輕輕混勻，室溫反應15分鐘。
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5.? 加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI，輕輕混勻，室溫避光處放置15分鐘。
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6.? 各試驗管中分別加入1′Binding Buffer緩沖液400μl。
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7.? 1小時內上流式細胞儀測定結果。