PreScission Protease產品說明書

保存條件：-20℃，一年有效。

1.產品簡介：

PreScission Protease是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（human rhinovirus (HRV) type 14 3C protease）和GST組成的融合蛋白。該蛋白酶可在低溫下（4°C）特異識別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進行酶切。底物的識別和切割不僅依賴于融合蛋白的一級結構還依賴于融合蛋白的二級和三級結構。它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達出的帶有酶底物識別多肽序列融合蛋白的GST標簽進行分離。本品由大腸桿菌中重組表達，以無菌液體形式提供。

2.產品來源：

大腸桿菌表達

3.純度：

經SDS-PAGE及HPLC分析，純度> 95%

4.緩沖液組分：

50 mM Tris，pH 8.0，0.5 mM EDTA，1 mM DTT

5.比活性：

1U/ul

6.酶活定義：

在5℃條件下反應16小時，能夠切割10μg的GST標簽的融合蛋白達90%以上所需的酶量定義為一個活性單位

7.使用方法：

工作液濃度應根據具體實驗確定，建議進行預實驗摸索最佳實驗濃度。

1）初始條件摸索a. 按照下表設置酶切反應體系：

b. 將反應混合物置于4℃反應15-16h；

c. 取20μL樣品進行SDS-PAGE電泳分析，根據結果，優化反應所需的最適酶量，重復步驟；

d. 在實際操作中，建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。

2）柱上酶切GST標簽蛋白（以10mg GST標簽蛋白/mL凝膠為例）

a. 4℃條件下，使用10倍柱體積酶切緩沖液洗滌已結合GST標簽蛋白的純化柱，并去除殘留緩沖液；

b.?準備PreScission Protease：約每100μg GST標簽蛋白使用2U PreScission Protease?(或按照經步驟1優化后的條件)。對于10mg?GST標簽蛋白需使用200U?PreScission?Protease，用PreScission酶切緩沖液稀釋至與凝膠柱相同的體積，即1mL。

c.?將稀釋好的1mL?PreScission?Protease泵入純化柱中，4°C保持4-8h（為確保酶切完全，可以4°C酶切過夜）。如果蛋白結合是在離心管中進行的，可將準備好的PreScission?Protease直接加入離心管中，4°C在搖床上緩慢搖動4-8小時（為確保酶切完全，可以4°C酶切過夜）。

d.?用1倍柱床體積的PreScission?Protease酶切緩沖液洗滌，重復三次，分別收集每次的洗滌液。如果酶切反應是在離心管中進行的，1000g離心2分鐘，收集上清，然后加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清，接著再加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清。洗脫組分中含有切除了GST標簽的目的蛋白，而GST標簽和帶有GST標簽的PreScission?Protease則仍然結合在凝膠柱上。

3）柱下酶切GST標簽蛋白（以10mg GST標簽蛋白/mL凝膠為例）

a. 使用脫鹽柱快速除去洗脫組分中的GSH、咪唑等特殊組分，或用PreScission Protease酶切緩沖液進行透析。

b. 按每100μg標簽蛋白加入2U PreScission Protease的比例加入蛋白酶，4°C孵育4-8h或者過夜。

c. 將酶切后的蛋白樣品加入預先用PreScission Protease酶切緩沖液平衡好的GST純化柱，室溫結合20-30分鐘。

d. 500g離心5分鐘，收集上清，其中含有切除了標簽的目的蛋白，PreScission Protease則結合在凝膠沉淀中。如果目的蛋白是GST標簽蛋白，那么殘留的沒有被酶切的GST標簽蛋白、PreScission Protease和酶切下來的GST標簽則結合在凝膠沉淀中，切除了標簽的目的蛋白在溶液中。

*本試劑僅供實驗室研究使用

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