PreScission Protease
產(chǎn)品名稱(chēng)： PreScission Protease
英文名稱(chēng)：
產(chǎn)品編號(hào)： FrdE00015
產(chǎn)品價(jià)格： null
產(chǎn)品產(chǎn)地： 中國(guó)
品牌商標(biāo)： Frdbio
更新時(shí)間： 2023-08-15T17:03:56
使用范圍： 僅供科研使用
- 聯(lián)系人 : 趙經(jīng)理
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PreScission Protease產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)
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產(chǎn)品編號(hào) |
產(chǎn)品名稱(chēng) |
規(guī)格 |
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FrdE00015 |
PreScission Protease |
200u/500u |
保存條件：-20℃，一年有效。
1.產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
PreScission
Protease是一種由人鼻病毒14型的3C蛋白酶（human
rhinovirus (HRV) type 14 3C protease）和GST組成的融合蛋白。該蛋白酶可在低溫下（4°C）特異識(shí)別短肽Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切。底物的識(shí)別和切割不僅依賴(lài)于融合蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)還依賴(lài)于融合蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。它可以特異性的將pGEX-6P系列等載體表達(dá)出的帶有酶底物識(shí)別多肽序列融合蛋白的GST標(biāo)簽進(jìn)行分離。本品由大腸桿菌中重組表達(dá)，以無(wú)菌液體形式提供。
2.產(chǎn)品來(lái)源：
大腸桿菌表達(dá)
3.純度：
經(jīng)SDS-PAGE及HPLC分析，純度>
95%
4.緩沖液組分：
50 mM Tris，pH 8.0，0.5
mM EDTA，1 mM DTT
5.比活性：
1U/ul
6.酶活定義：
在5℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，能夠切割10μg的GST標(biāo)簽的融合蛋白達(dá)90%以上所需的酶量定義為一個(gè)活性單位
7.使用方法：
工作液濃度應(yīng)根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)確定，建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳實(shí)驗(yàn)濃度。
1）初始條件摸索a. 按照下表設(shè)置酶切反應(yīng)體系：
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反應(yīng)物組成 |
體積 |
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GST融合蛋白 |
100μg |
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Prescission Protease |
2μL（1U/μL） |
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10×Cleavage Buffer |
10μL |
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ddH2O |
至100μL |
b. 將反應(yīng)混合物置于4℃反應(yīng)15-16h；
c. 取20μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，根據(jù)結(jié)果，優(yōu)化反應(yīng)所需的最適酶量，重復(fù)步驟；
d. 在實(shí)際操作中，建議酶用量1:25-1:100U/μg融合蛋白。
2）柱上酶切GST標(biāo)簽蛋白（以10mg GST標(biāo)簽蛋白/mL凝膠為例）
a. 4℃條件下，使用10倍柱體積酶切緩沖液洗滌已結(jié)合GST標(biāo)簽蛋白的純化柱，并去除殘留緩沖液；
b.?準(zhǔn)備PreScission Protease：約每100μg GST標(biāo)簽蛋白使用2U PreScission Protease?(或按照經(jīng)步驟1優(yōu)化后的條件)。對(duì)于10mg?GST標(biāo)簽蛋白需使用200U?PreScission?Protease，用PreScission酶切緩沖液稀釋至與凝膠柱相同的體積，即1mL。
c.?將稀釋好的1mL?PreScission?Protease泵入純化柱中，4°C保持4-8h（為確保酶切完全，可以4°C酶切過(guò)夜）。如果蛋白結(jié)合是在離心管中進(jìn)行的，可將準(zhǔn)備好的PreScission?Protease直接加入離心管中，4°C在搖床上緩慢搖動(dòng)4-8小時(shí)（為確保酶切完全，可以4°C酶切過(guò)夜）。
d.?用1倍柱床體積的PreScission?Protease酶切緩沖液洗滌，重復(fù)三次，分別收集每次的洗滌液。如果酶切反應(yīng)是在離心管中進(jìn)行的，1000g離心2分鐘，收集上清，然后加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清，接著再加入1mL酶切緩沖液重懸沉淀，離心(1000g×2min)收集上清。洗脫組分中含有切除了GST標(biāo)簽的目的蛋白，而GST標(biāo)簽和帶有GST標(biāo)簽的PreScission?Protease則仍然結(jié)合在凝膠柱上。
3）柱下酶切GST標(biāo)簽蛋白（以10mg GST標(biāo)簽蛋白/mL凝膠為例）
a. 使用脫鹽柱快速除去洗脫組分中的GSH、咪唑等特殊組分，或用PreScission
Protease酶切緩沖液進(jìn)行透析。
b. 按每100μg標(biāo)簽蛋白加入2U PreScission
Protease的比例加入蛋白酶，4°C孵育4-8h或者過(guò)夜。
c. 將酶切后的蛋白樣品加入預(yù)先用PreScission
Protease酶切緩沖液平衡好的GST純化柱，室溫結(jié)合20-30分鐘。
d. 500g離心5分鐘，收集上清，其中含有切除了標(biāo)簽的目的蛋白，PreScission
Protease則結(jié)合在凝膠沉淀中。如果目的蛋白是GST標(biāo)簽蛋白，那么殘留的沒(méi)有被酶切的GST標(biāo)簽蛋白、PreScission
Protease和酶切下來(lái)的GST標(biāo)簽則結(jié)合在凝膠沉淀中，切除了標(biāo)簽的目的蛋白在溶液中。
*本試劑僅供實(shí)驗(yàn)室研究使用