基因敲除

簡介

? ? ? CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系統是目前被廣泛運用的基因編輯系統，其原理是由CRISPR轉錄產生的gRNA介導Cas核酸酶靶向目標序列，對序列進行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系統，此系統是由II類CRISPR/Cas系統改造而來，能夠在植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物等多種細胞中，進行有效的靶向編輯，具有操作簡易、效率高、以及作用靶位點多等優勢。

? ? ? CRISPR/Cas9系統中sgRNA(short?guide RNA)識別并結合目標基因的靶向序列，引導Cas9對結合位點進行剪切，產生DNA雙鏈斷裂（double-strand break, DSB），機體自身通過非同源重組（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修復DSB，參與修復的蛋白經常會在DNA末端插入或刪除幾個堿基，修復后的基因由于產生突變而導致功能喪失，從而實現機體內的基因敲除。

CRISPR/Cas9系統介導的基因編輯（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）

應用

? ? ? 1.?CRISPR/Cas9基因敲除細胞系建立

? ? ? 2.?CRISPR/Cas9基因敲除建立動物疾病模型

技術優勢

? ? ? 1.?操作簡易：僅需Cas9核酸酶和sgRNA即可對目標基因靶位點進行切割；

? ? ? 2.?效率高：在基因組水平上編輯目標基因，高度模擬目標模型，可精確編輯基因組；

? ? ? 3.?作用靶位點多：可實現多個靶基因位點及多個基因的同時敲除；

? ? ? 4.?提供多種基因編輯病毒工具：AAV、LV；

? ? ? 5.?提供BSL-1和BSL-2病毒注射及實驗操作平臺；

? ? ? 6.?全面的實驗技術支持。

服務內容

? ? ? 1.?sgRNA的設計；

? ? ? 2.?細胞內sgRNA剪切活性篩選；

? ? ? 3.?敲除載體的構建；

? ? ? 4.?依據所要編輯的細胞選擇Cas9和sgRNA不同導入方式：

? ? ? ? ? ? ? a、脂質體易轉染細胞：使用質粒系統（Cas9和sgRNA）；

? ? ? ? ? ? ? b、 脂質體難轉染細胞：使用質粒系統電轉化、慢病毒或腺相關病毒感染（Cas9和sgRNA）；

? ? ? 5.?篩選基因敲除單克隆細胞系。

服務流程

客戶提供

? ? ? 1.?目的基因基因序列（序列/ID）以及物種來源；

? ? ? 2.?需介導基因敲除的細胞（可選）；

? ? ? 3.?病毒類型選擇以及要求；

? ? ? 4.?血清型選擇。

服務信息及最終交付內容、產品

案例展示

? ? ? Haoyi?Wang等人研究發現，CRISPR / Cas介導的基因編輯允許高效地同時破壞小鼠胚胎干（ES）細胞中的五個基因（Tet1，2，3，Sry，Uty-8等位基因），通過NHEJ引入多個隨機indel的靶向突變。將靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中，在兩種基因中產生具有雙等位基因突變的小鼠，效率為80％。CRISPR / Cas系統允許一步產生攜帶多個基因突變的動物，這種方法將大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的體內研究。

小鼠胚胎干細胞的多基因敲除（Wang H et al. Cell, 2013）

小鼠和小鼠胚胎干細胞的多基因編輯（Wang H et al. Cell, 2013）

參考文獻

? ? ? 1.?Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).

? ? ? 2.?Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.